菠萝超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定重庆师范大学 生命科学学院 生物科学2003级 梁慧指导教师:许平摘要:本文采用硫酸铵分级沉淀,透析,DEAE-纤维素A-52离子交换柱层析从菠萝中分离纯化SOD并采用Folin-酚法测蛋白质含量,邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性,得到酶的比活力为47 u/mg•pr,回收率为45 %,提纯倍数40 的SOD同时得到了电泳纯一的SOD。并且分别研究了不同pH值、温度对菠萝SOD活性的影响。结果表明:菠萝中SOD的活力在20-60℃和pH 8—6范围内稳定。且在温度为25℃,pH为2的条件下活力最大。这一研究提供了从高等植物中提取SOD的有效方式。关键词:超氧化物歧化酶;菠萝;邻苯三酚自氧化;活性测定The Measurement of Activity of Pineapple SODGrade 2003 Biology Science Chongqing Normal University LianghuiTutor:XupingAbstract:In the paper,Superoxide dismutases (SOD) from pineapple was purified by a combination of ammonium sulfate fractionation,dialysis and DEAE-cellulose A-The purified enzyme was a highly homogeneous protein with the specifec activity of 47u/mg• The yield rate is about 45 %,and the multiplication is as high as 40 The results showed that the enzyme was a manganese And we measured the enzyme in different pH,temperature.The results showed that:the enzymatic activity of pineapple is stable within the temperature 20—60℃ and pH 8— In the condition of T=25℃, pH=2 is confirmed to be the best This study provides an effective approach for SOD research on higher Key Words:Superoxide dismutase;pineapple;pyrogallot autoxidation;activity 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD),是一类广泛存在于生物体内的金属酶,能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,平衡机体内的氧自由基,SOD是一类重要的自由基清除剂,它催化超氧阴离子自由基O-与H+发生歧化反应,生成H2O2和02,反应式如下: 过氧化氢在过氧化氢酶的作用下进一步分解生成H2O和O2,消除O-等中间物的毒性。由于O-性质活泼,极具破坏作用,因而当机体内有过多O-积累时可诱发多种疾病。SOD作为体内自由基的有效清除剂,能使自由基的形成和消除处于动态的平衡,从而抵御O-的毒害作用[1]。因此,SOD已成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂,SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用[2]。目前,世界各地学者对SOD的研究方兴未艾,深入研究SOD不仅有着重大的理论意义,也有着重大的实际应用价值。已开发的SOD资源有动物血、刺梨、麦叶、果蔬及微生物等。目前,我国主要是从动物血液中提取,并已从牛血中成功地获得高纯度的Cu,Zn—SOD,国外药用S0D系从牛血中提取,但动物饲养容易受到饲料、疾病(如疯牛病)及饲养环境等因素的影响,而用植物原料提取SOD前景广阔。特别是近年来SOD功能果品系列产品开始流行,其是纯天然食品,没有任何副作用,无污染,无残毒。人们在食用美味果品的同时,又获得了当前最流行的保健食疗品。如SOD猕猴桃,SOD草莓,SOD柑橘。对水果中SOD活性的测定已成为必要,而菠萝是深受人们喜爱的水果之一,对其SOD活性的测定具有一定的实际意义。资料表明[3],菠萝味甘、微酸,性微寒,有清热解暑、生津止渴、利小便的功效,可用于伤暑、身热烦渴、消化不良、小便不利、头昏眼花等症。而且在果汁中,还含有一种跟胃液相类似的酵素,可以分解蛋白,帮助消化。菠萝营养丰富,其成分包括糖类、蛋白质、脂肪、维生素A、B1、B2、C、蛋白质分解酵素及钙、磷、铁、有机酸类、尼克酸等,尤其以维生素C含量最高。据专家研究表示,菠萝中所含的蛋白质分解酵素可以分解蛋白质及助消化,对于长期食用过多肉类及油腻食物的现代人来说,是一种很合适的水果。另外,菠萝的诱人香味则是来自其成分中的酸丁酯,具有刺激唾液分泌及促进食欲的功效。经研究菠萝中含有较丰富的SOD,为此,我们以菠萝为原料,探索从菠萝中提取SOD的方法,并对其理化性质进行研究,为SOD新资源对开发提供了依据。1 实验材料1 原料 菠萝(Artocarpus heterophyllus)2 试剂 pH= 2,的1mol/L Tris-HCl 缓冲液(内含002mol/L EDTA),(NH4)2SO4(分析纯), 邻苯三酚,01mol/LHCl, 1%BaCl2,聚乙二醇,牛血清蛋白,DEAE-纤维素A-52,考马斯亮蓝R-3 仪器 分光光度计;高速冷冻离心机;电子天平;电热三用水箱;微量进样器;透析袋;DDB-320智能型蠕动泵;电热鼓风干燥箱;DYY-2C型电泳仪;DYY-Ⅲ型电泳槽;B52-100自动部分收集器;冰箱;秒表2 实验方法1 提取纯化及SOD稳定性研究的方法1 粗提液的制备 取新鲜的菠萝50g。切成小块状,加入1mol/LpH2的Tris-HCl缓冲液(内含002mol/L EDTA),研磨,四层纱布过滤,收集滤液。于4℃,在4000rpm下离心15min,上清液即为粗提液,共90ml。2 酶的纯化[4] ①盐析:取20ml的粗提液,加硫酸铵52克至30%饱和度,用玻璃棒搅匀,静置2小时(4℃),4000rpm,4℃离心15min,取10ml上清液,加入56克硫酸铵固体粉末至80%的饱和度,静置4小时后离心(4000rpm,15min,4℃),去清液,沉淀备用。②透析:沉淀用25ml的pH8的磷酸缓冲液溶解,装入透析袋,用25mlpH 8的磷酸缓冲液透析除盐,过夜除尽硫酸铵,用1%的BaCl2检查。③浓缩:用聚乙二醇包埋法浓缩2小时至浓缩液5ml。④过层析柱:浓缩液用预先用碱-酸处理并经磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素A-52(5×20cm)上柱,用pH8的磷酸缓冲液洗脱,洗脱速度每管3ml/3min,收集有酶活的洗脱液。共收集50管。首先,每隔5管测其蛋白质含量以及其SOD活性,找到蛋白质含量及SOD活性均较高的一管,再细测其周围管。⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳[5]:分离胶浓度为7.5%(pH 9),浓缩胶浓度为3%(pH 7),电极缓冲液为Tris-Gly缓冲液(pH3)。上样量每管为100微升。电泳时,采取稳流电泳,开始时用1-2mA/管,电泳1-2分钟,再升高电流到约3-5mA/管,电泳时间约3h。3 粗提液的稳定性研究①酸碱稳定性[6]:分别利用Tris-HCl配制pH为4,8,2,6,9的缓测定酶活力,并以酶活性最大时所在pH的酶活性为100%,其余各管以此作为参照;②温度稳定性:在温度20℃,25℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃,80℃下测定酶活力,并以酶活性最大时所在温度的酶活性为100%,其余各管以此作为参照。2 分析方法1 SOD活性的测定: 邻苯三酚自氧化法①邻苯三酚自氧化速率A0的测定[7、8]:按表一次序加样,每隔5min于320nm处读一次吸光值A320nm,则邻苯三酚自氧化速率A0=(A4-A1)/3,A1和A4分别为0和