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收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1，2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA 0mg/L（单位下同）+ TDZ 03；MS + 6-BA 0 + TDZ 03 + NAA 1 培养基能较好地诱导分化出丛生芽， 继代增殖培养中与MS + 6-BA 0 + TDZ 03 + NAA 1 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达67；适宜的生根培养基为MS + 6-BA 0 + NAA 5，生根率达67%，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号：Q1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1，2， LEI Jiang-li2， WU Yan-min3， LÜ Hui2， YU Ji-hua1(College of Agronomy， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu China; Shenzhen Institute of LandscapeGardening， Shenzhen 518003， Guangdong China; Biotechnology Research Institute， Chinese Academy of AgriculturalSciences， Beijing 100081， China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA 0mg/L+ TDZ03mg/L; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA 0mg/L +TDZ 03mg/L + NAA 1mg/L; using MS + 6-BA 0mg/L + TDZ 03mg/L + NAA 1mg/L asproliferation medium， an optimal proliferation rate was When the two kinds of mediumused alternatively， the effect was The optimum rooting medium was MS + 6-BA 0mg/L +NAA 5mg/L， the rate of rooting could reach 67%， and cultured in this medium， the plant grewwell and easy to Key words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2，3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008，37(1):33-Subtropical Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法1 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。2 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（1%升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 1%升汞5min、2%次氯酸钠 + 1%升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。3 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 8。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析1 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。1%升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 1%升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 1%升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用1%升汞处理10min 进行外植体消毒。2 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2，4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，05～0μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为33%，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达33%，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/5 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况1%升汞10min 30 5 67 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 00 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 33 20%有轻微药害2%次氯酸钠+1%升汞5min 30 10 33 3%有轻微药害2%次氯酸钠+1%升汞10min 30 5 67 7%有药害第1 期 王丹，等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。3 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（03mg/L）的分化促进作用较高浓度（3mg/L）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当TDZ03mg/L 时， NAA 1mg/L 促分化作用显著优于NAA5mg/L。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。4 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA 0 + NAA 5培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2，4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 33 参考[2]3 5 0 0 0 0 33 参考[3]4 3 0 0 0 0 675 2 1 0 0 0 006 2 5 0 0 0 677 2 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 2 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 2 012 0 1 0 0 2 33 参考[8]13 0 0 5 0 1 3314 0 0 1 0 1 6715 8 0 0 0 03 3316 5 0 5 0 03 00表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 0 5 03 30 00d 20d ++18 0 5 30 30 67cd 50bc ++19 0 1 03 30 67a 67a ++20 0 1 30 30 33cd 46bc ++21 0 5 03 30 33c 60ab ++22 0 5 30 30 67d 33c ++23 0 1 03 30 67a 60ab ++24 0 1 30 30 33ab 57b +25 0 5 03 30 00b 53b ++26 0 5 30 30 67d 37c +27 0 1 03 30 00a 73a ++28 0 1 30 30 67d 37c +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜05＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 5 30 19 33b +30 0 0 30 21 00a ++31 0 5 30 20 67ab +++32 0 0 30 16 33c ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，1%升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA 0 + ZDT 03 + NAA 1 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA 0 + TDZ 03+ NAA 1 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA 0 + NAA 5 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W， et The genus Canna in Northern South America[J] Acta Bot N， 1971，20(6): 663-[2] 刘文萍，等 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J] 北方园艺， 2001(6): [3] 丁爱萍，等 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J] 园林科技， 2006(1): 11-[4] Singh N D， et The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L Millsp)[J]Plant Science， 2003，164(3): 341-[5] 王关林，等 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J] 植物学通报， 1997，14(3): 47-[6] 宣朴，等 生姜茎尖组培快繁技术研究[J] 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自然科学论文——遗传学论文 论文概要：介绍遗传，变异，生物物种多样性的概念及它们之间的关系，还有人类对生物资源的创造和利用状况。并且，在论述中强调了对这些生物资源的利用要合理适当，要保护自然界生物多样性。 首先，让我们来看看遗传，变异及生物多样性的概念及其所包含的一些内容： 1．遗传：是指生物亲代与子代之间、子代个体之间相似的现象，一般是指亲代的性状又在下一代表现的现象。但在遗传学上，是指遗传物质从上代传给后代的现象。 2．变异：生物有机体的属性之一，它表现为亲代与子代之间的差别。变异有两类，即可遗传的变异与不遗传的变异。现代遗传学表明，不遗传的变异与进化无关，与进化有关的是可遗传的变异，后一变异是由于遗传物质的改变所致，其方式有突变与重组。 突变可分为基因突变与染色体畸变。基因突变是指染色体某一位点上发生的改变，又称点突变。发生在生殖细胞中的基因突变所产生的子代将出现遗传性改变。发生在体细胞的基因突变，只在体细胞上发生效应，而在有性生殖的有机体中不会造成遗传后果。染色体畸变包括染色体数目的变化和染色体结构的改变，前者的后果是形成多倍体，后者有缺失、重复、倒立和易位等方式。突变在自然状态下可以产生，也可以人为地实现。前者称为自发突变，后者称为诱发突变。但是自发突变通常频率很低，诱发突变是指用诱变剂（X射线，γ射线、中子流及其他高能射线，5-嗅尿嘧啶、2-氨基嘌呤、亚硝酸等化学物质，以及超高温、超低温等）所产生的人工突变。 3．生物多样性：指一定范围内多种多样活的有机体(动物、植物、微生物) 有规律地结合所构成稳定的生态综合体。 这种多样性包括动物、植物、微生物的物种多样性，物种的遗传与变异的多样性及生态系统的多样性。其中，物种的多样性是生物多样性的关键，它既体现了生物之间及环境之间的复杂关系，又体现了生物资源的丰富性。 另外，遗传（基因）多样性是指生物体内决定性状的遗传因子及其组合的多样性。物种多样性是生物多样性在物种上的表现形式，可分为区域物种多样性和群落物种（生态）多样性。生态系统多样性是指生物圈内生境、生物群落和生态过程的多样性。（1） 知道了遗传，变异及自然界生物物种多样性的概念，下面让我们来看看它们之间的关系： 首先来看遗传与变异的关系：遗传与变异是矛盾的但又对立统一的关系。由于遗传而确保了生物的稳定性和世代延续性，是相对“不变”的；而变异是绝对的“变”，它使生物原有的特性发生改变，从而产生出新的生物性状或类型，为生物的进化与发展提供动力。没有变异，遗传只能是简单的重复，生物就无法进化。因此，在维持物种的稳定性上，遗传与变异是对立的。然而，没有遗传，变异就不能积累，新的变异就失去了意义，生物同样也不能进化。所以，在进化方面，遗传和变异又是统一的。 理清了遗传与变异的关系，现在再来看遗传和变异与自然界生物物种多样性的关系： 遗传与变异是自然界生物多样性的基础，是遗传和变异为生物的发展、进化提供了原材料。具体来说，遗传是生物稳定性的基础，变异是生物多样性的前提，两者是对立统一的关系。在遗传和变异的共同作用下，自然界生物存在着多样性，同时各种生物又具有其自身的特点，能够与其它生物种类加以区分。总之，没有变异，自然界就不会多姿多彩，就不会有自然界的多样性；没有遗传，自然界就会处于无序状态，也不会有自然界的多样性。 （2） 现在，我们已经知道了遗传和变异与自然界生物物种多样性的关系，那么生物多样性有什么价值，人类又是怎样利用的呢？让我们来看看下面的资料： 一．1993年，联合国环境署组织专家编写的《生物多样性国情研究指南》中，将生物多样性价值划分为5种类型： 1．具显著实物形式的直接价值； 2．无显著实物形式的直接价值； 3．间接价值； 4．选择价值； 5．消极价值。（3） 二．表一： 中国生物多样性国情研究报告的价值分类系统 主要价值类型 直接使用价值 间接价值 选择价值或潜在价值 存在价值或内在价值 产品及加工品直接使用价值 服务价值 对人们提供效益的典型用途 林业，农业，畜牧业，渔业，医药业，工业，餐饮业，消费性利用价值 旅游观光价值，科学文化价值，畜力使役价值 有机物生产，维持大气平衡，物质平衡，水土保持，净化环境 潜在使用价值，潜在保留价值 确保自己或别人将来能利用某种资源或某种效益 从资料中可以看出：生物多样性是全人类共有的宝贵财富。生物多样性为人类的生存与发展提供了丰富的食物、药物、燃料等生活必需品以及大量的工业原料。生物多样性维护了自然界的生态平衡，并为人类的生存提供了良好的环境条件。生物多样性是生态系统不可缺少的组成部分，人们依靠生态系统净化空气、水，并充腴土壤。此外，科学实验证明，生态系统中物种越丰富，它的创造力就越大。自然界的所有生物都是互相依存，互相制约的。每一种物种的绝迹，都预示着很多物种即将面临死亡。 生物多样性还具有重要的科学研究价值。每一个物种都具有独特的作用，例如利用野生稻与农田里的水稻杂交，培育出的水稻新品种可以大面积提高稻谷的产量。在一些人类没有研究过的植物中，可能含有对抗人类疾病的成分。这些野生动植物如果绝迹，是人类的重大损失。另外，生物物种资源是国民经济持续发展的基础，是人类生存和社会可持续发展的战略性资源，也是农业发展的基石。每个生物物种都包含丰富的优良基因，基因资源的挖掘可以给国家带来财富，给人类带来文明。一个基因甚至可以影响一个国家的经济，乃至一个民族的兴衰。矮秆基因的发现导致了全世界粮食生产的“绿色革命”；水稻雄性不育基因的利用，创造了中国杂交稻的奇迹；优质羊毛基因的育种应用直接繁荣了澳大利亚的畜牧业生产。过去数十年来，全世界植物新品种不断推新，粮食亩产快速提高，正是得益于生物物种及其遗传多样性的贡献。生物物种资源的拥有和开发利用程度已成为衡量一个国家综合国力和可持续发展能力的重要指标之一 。（4） 因此，我们可以毫不夸张的说：生物多样性是人类赖以生存和社会可持续发展的物质基础，对于人类的生活起着极其重要的作用！ 因为生物多样性如此重要，而生物多样性保护不仅能对当代产生最大的持续利益，而且还能造福子孙后代。因此，开展生物多样性的研究，保护和可持续利用成为各国政府及社会各界有识之士共同关注的主要问题。下面就让我们来谈谈这个问题： 保护生物多样性的措施主要有三条：(1)建立自然保护区。建立自然公园和自然保护区已成为世界各国保护自然生态和野生动植物免于灭绝并得以繁衍的主要手段。我国的神农架、卧龙等自然保护区，对金丝猴、熊猫等珍稀、濒危物种的保护和繁殖起到了重要的作用。(2)建立珍稀动物养殖场。由于栖息繁殖条件遭到破坏，有些野生动物的自然种群，将来势必会灭绝。为此，从现在起就必须着手建立某些珍稀动物的养殖场，进行保护和繁殖，或划定区域实行天然放养。如泰国对鲜鱼的养殖。(3)建立全球性的基因库。如为了保护作物的栽培种及其它可能会灭绝的野生亲缘种，建立全球性的基因库网。现在大多数基因库贮藏着谷类、薯类和豆类等主要农作物的种子。（5） 在保护生物多样性的基础上，人类可以通过一些方法（比如说诱变，基因合成，转基因等）创造出更多人类生活所需的物种，从而满足人类各种各样的需求。另外还有一些方法可产生新物种，如利用激素处理，植物的组织培养技术，但它们要么无法产生新的品种，要么把产生的变异遗传下去，这样在一定程度上影响了效率。 19世纪初，孟德尔的遗传定律被重新提出； 20年代，美国人将杂交原理运用到玉米育种上，取得了显著效果； 40年代，育种的手段中又增加了杂交转导，转化的技术； 50年代，美国人发现了DNA分子的双螺旋结构模型，分子生物学开始发展； 70年代，中国将杂交原理应用于水稻增产，获得了巨大的成功； 现在，只要我们作好当下的生物资源的保护工作，当我们展望未来时，我们有理由相信：到那时，生物资源的研究和利用将带给人类更多的财富！ 参考资料：（1），（2），(5)百度论坛 （3）联合国环境署中相关材料 （4）中国食品产业网 （6）图片来源：百度图片库
