千目千聪
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用 【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。 【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平 在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。 1 传统光学显微镜的分辨率 光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function， PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。 根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]： 横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■ 轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■ 可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径NA等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径， 用折射率很高的材料。 Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。 2 高分辨率三维显微术 在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy， 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。 共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。 3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上K1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy， I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent， interference， illumination microscopy， I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion， STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12，13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率，还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation， SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色，可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。 3 表面高分辨率显微术 表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope， NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域， 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance， SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。 1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。 【参考文献】 [1] 汤乐民，丁 斐生物科学图像处理与分析[M]北京:科学出版社，2005： [2] Kam Z， Hanser B， Gustafsson MGL， et Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J] Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:3790- [3] Booth MJ， Neil MAA， Juskaitis R， et Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J] Proc Natl Acad Sci USA，2002， 99:5788- [4] Goldman RD，Spector DLLive cell imaging a laboratory manual[J]Gold Spring Harbor Laboratory Press， [5] Monvel JB，Scarfone E，Calvez SL，et Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J]Biophys，2003，85:3991- [6] 李栋栋，郭学彬，瞿安连以三维荧光反卷 
传统的光学显微镜主要由光学系统及支撑它们的机械结构组成，光学系统包括物镜、目镜和聚光镜，都是由各种光学玻璃做成的复杂化了的放大镜。物镜将标本放大成像，其放大倍率M物由下式决定：M物=Δ∕f"物 ，式中f"物是物镜的焦距，Δ可理解为物镜与目镜间的距离。目镜将物镜所成之像再次放大，成一个虚像在人眼前250mm处供人观察，这是多数人感觉最舒适的观察位置，目镜的倍率M目=250/f"目，f"目是目镜的焦距。显微镜的总放大倍率是物镜与目镜的乘积，即M=M物＊M目=Δ＊250∕f"目＊f;物。可见，减小物镜及目镜焦距将使总放大倍率提高，这是用显微镜可以看到细菌等微生物的关键，也是其与普通放大镜的区别所在。 那么，是否可以设想无限制地减少f’物f’目，以便提高放大倍率，使我们能看到更加细微的物体呢？回答是否定的！这是因为用以成像的光本质是一种电磁波，因而在传播过程中免不了产生衍射和干涉现象，就像日常所见水面的波纹遇到障碍时能绕行，两列水波相遇时能互相加强或削弱一样。当从一个点状的发光物点发出的光波进入物镜时，物镜的边框阻碍了光的传播，产生衍射和干涉，经物镜后无法再会集于一点，而是形成有一定大小的光斑，外围还有强度微弱并逐渐减弱的一系列光环，我们称中心亮斑为艾里斑，两个发光点靠近到一定距离时两光斑就会重叠，直至无法确认为两个光斑。瑞利提出了一个判定标准，认为当两光斑中心相距等于艾里斑半径时，两光斑是能分辨的，经计算，这时候两个发光点间的距离e=61入∕sinA=61入∕NA，式中，入为光波波长，人眼可接收的光波波长约为4—7um，n为发光点所处介质的折射率，如处在空气中，n≈1，处在水中，n≈33，而A为发光点对物镜边框张角之半，NA称为物镜的数值孔径。从上式可见，物镜能分辨的两点间的距离受到了光的波长和数值孔径的限制，由于人眼视觉最敏锐的波长约为5um，而A角不可能超过90度，sinA总小于1，对于可用的透光介质最大折射率约为5，故 e值始终大于2um，这是光学显微镜能分辨的最小极限距离。通过显微镜放大成像，若想将能被具有某些NA值的物镜分辨率的物点间距e放大到足以被人眼分辨，则需M≥15mm，此处15mm为实验得出的人眼能分辨的置于眼前250mm处两微物间的最小距离，故M≥（15∕61入）NA≈500NA ，为使观察不致太费力，M扩大一倍便足够了，即500NA≤M≤1000NA，是显微镜总倍率的合理选取范围，再大的总放大倍率是没有意义的，因为物镜数值孔径已经限制了最小可分辨距离，提高放大倍率已不可能分辨出更小的物体细节了。 成像衬度是光学显微镜的另一个关键问题，所谓衬度，即是像面上相邻部份间的黑白对比度或颜色差，人眼对于02以下的亮度差别是很难判定的，对颜色差别则稍微敏感一些。有些显微镜观察对象，如生物标本，其细节间亮度差别甚小，加之显微镜光学系统设计制造误差使其成像衬度进一步降低而难于分辨，此时，看不清物体细节，不是总放大倍率过低，也不是物镜数值孔径太小，而是由于像面衬度太低的缘故。 多少年来，人们为提高显微镜的分辨能力和成像衬度付出了艰辛的劳动，随着计算机技术和工具的不断进步，光学设计的理论和方法也在不断改进，加上原材料性能的提高，工艺和检测手段的不断完善，观察方法的创新，使光学显微镜的成像质量已经接近衍射极限的完善程度，人们将用标本染色、暗场、相衬、荧光、干涉、偏光等观察技术，使得光学显微镜已能适应形形色色标本的研究，虽然近年来电子显微镜，超声显微镜等放大成像仪器先后问世，在某些方面具有优势的性能，但在廉价、方便、直观、特别是适合生物活体的研究等方面仍无法与光学显微镜匹敌，光学显微镜仍然牢固地占据着自己的阵地。另一方面，与激光、计算机、新材料技术、信息技术相结合，古老的光学显微镜正焕发青春，显示了旺盛的生命力，数码显微镜、激光共焦扫描显微镜、近场扫描显微镜、双光子显微镜及具有各种新的功能或能适应各种新的环境条件的仪器层出不穷，更加扩大了光学显微镜的应用领域，作为最新的例子。从火星探测车上传回的岩层显微图片是多么令人振奋！我们完全可以相信，光学显微镜将会以更新的姿态，造福人类。
你不需要资料 需要的是对原理的了解 你问问 物理老师 他可以详细给你讲 我也知道 可以给你直接设计 不过你需要多大倍数的呢？
镁合金是目前最轻的金属结构材料，其具有低的密度、熔点、动力学黏度、比热容、相变潜热以及和铁的亲和力小等特点;而且其比强度要高于铝合金和钢;其机械加工性能优良，易加工，加工能量仅是铝合金的70%;其耐蚀性要高于低碳钢，已超过了压铸铝合金A380;所以，综合性能优良的镁合金被誉为“21世纪金属”，并广泛应用于汽车、计算机、通讯、航空航天等领域。其中，AZ91D镁合金是目前工业生产中应用最为普遍的一种铸造用镁合金。但是镁合金材料自身的强度低、脆性大、耐蚀性差和高温性能差等缺点又限制了其在工业生产中的应用。要想提高镁合金各方面的性能，就需要系统、全面的对镁合金做基础性的研究。本实验主要研究机械振动的频率和时间对AZ91D镁合金凝固过程的影响，同时探讨了在凝固的不同阶段施加振动时对AZ91D镁合金凝固过程的影响。利用光学显微镜(OM)、TH160里氏硬度计、微机控制电子式万能拉伸试验机和温度采集系统等测试方法，系统的研究了机械振动对AZ91D镁合金组织和力学性能的影响。在镁合金凝固过程中施加不同的振动频率的研究结果为:(1)初生α-Mg相的形貌由铸态下粗大的枝晶转变成为均匀细小的团块状，绝大多数的β相以连续的网状分布于晶界处，分布比较均匀，弥散分布的第二相数量减少。(2)增大振动频率有利于减小晶粒平均直径，α-Mg相的平均晶粒直径最大的减少了5%。(3)随着振动频率的增加，合金的强度、硬度、伸长率也逐渐的增大，在50Hz时合金的强度、硬度、伸长率分别达到了4MPa、106HB、75%，相比铸态下的分别提高了8%、7%、09%。在镁合金凝固的过程中施加不同的振动时间的研究结果是:(1)初生的α-Mg相形貌由一次枝晶臂很长的粗大枝晶转变成为较均匀的细小的等轴晶;第二相β-Mg_(17)Al_(12)由粗大的骨骼状形态转变成为网状连续的形态分布在晶界处，弥散分布的第二相的数量减少。(2)延长振动时间有利于减小晶粒的平均直径，在振动时间为120s时α-Mg相的平均晶粒直径的减少了5%(3)镁合金的最大硬度提高76%、最大抗拉强度增加6%、最大伸长率增加7%。在镁合金凝固的不同阶段对镁合金熔体施加机械振动的研究结果为:(1)液相线以上时开始振动(浇注60s后开始振动)和开始结晶的前期阶段施加振动(浇注后150s开始振动)时都能很好的细化α-Mg相，获得等轴晶，绝大多数的β-Mg17Al12相成网状分布于晶界处，在液相线以上就开始振动时，效果更理想。而在结晶的后期阶段开始振动时(浇注后580s开始振动)，细化效果不明显，α-Mg相仍以粗大的枝晶状态存在，弥散的第二相比较均匀的分布在α相内，其余的β-Mg_(17)Al_(12)相成网状分布于晶界处。(2)在凝固的不同阶段施加振动时，开始振动的时间越晚，合金的强度、硬度、伸长率都有减小的趋势。采用热分析法，在不同振动频率下，测得了AZ91D镁合金的凝固温度曲线，结果表明:施加机械振动能缩短镁合金的凝固时间，而且振动频率越大，镁合金凝固时间越短。
