小鹏哥
探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞(DC)体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以β-gal为模拟抗原，以转染有LacZ基因并稳定表达β-gal的淋巴瘤细胞E22为肿瘤细胞模型，用携带编码β-gal的LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)转染小鼠骨髓DC，检测转染的效率及LacZ基因修饰DC刺激T细胞增殖的能力，观察皮下免疫LacZ基因修饰DC后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及诱导产生CTL和抵抗E22细胞再攻击的能力。结果：LacZ基因修饰后24、48、72 h，均能检测到80％以上的DC表达β-gal，此基因修饰的DC可有效刺激同基因型小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应；将其皮下免疫小鼠1 w 后再接种E22细胞，小鼠的存活期较其他DC免疫小鼠显著延长，但对B16黑色素瘤细胞的攻击无免疫保护作用。此外，LacZ基因修饰的DC免疫小鼠的引流淋巴结细胞数量显著增加，且产生了针对E22的而非EL-4或B16的特异性CTL。结论：腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的DC能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。 树突状细胞(Dendritic cells，DC)是目前所知的是功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Nat-ive T cell) 的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)，在免疫应答中处于中心地位。近年来体外大量扩增DC的方法日益成熟，使DC用于肿瘤治疗受到重视［1，2］。Porgador 等用MHC I类分子限制的肿瘤抗原多肽体外致敏的DC免疫小鼠，不但诱导产生了特异性CTL，同时也使小鼠获得了抵抗肿瘤再攻击的能力［3，4］。本室曾用GM-CSF基因修饰的DC经肿瘤抗原体外致敏后或与肿瘤细胞融合后免疫小鼠，使小鼠产生了更强的特异性抗肿瘤免疫反应［5，6］。若将肿瘤抗原基因转染至DC并使之持续表达，有可能更有效地发挥DC的抗原提呈作用，而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。Chen等曾以LacZ基因作为模拟的抗原基因、以其表达产物β-半乳糖苷酶(β-gal)作为模拟的抗原并以转染了LacZ基因、能稳定表达β-gal的胸腺淋巴瘤细胞EL-4的亚克隆E22为模型研究抗原特异性抗肿瘤免疫反应［7］，鉴于将β-gal为模拟抗原的实验体系稳定、简便、明确，因此，我们利用E22为肿瘤细胞模型，通过携带有编码LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)的介导，探讨腺病毒介导的抗原基因修饰的DC能否诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，为以DC为基础的肿瘤主动性免疫基因治疗提供实验依据。 DC刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力的检测 经上述基因修饰的DC，加入丝裂霉素C，终浓度为25 μg/ml，于34℃孵箱中孵育45 min，洗2次，作为刺激细胞。取经灭活E22细胞免疫1 w后的C57BL/6小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，Tris-NH4Cl溶去红细胞，洗2次后注入尼龙毛柱，置37℃孵育1 h，预热的PBS(37℃)冲洗出非粘附细胞，作为T细胞即反应细胞。将DC与T细胞按1∶100、1∶330、1∶1 000的比例在96孔培养板上培养72 h，于结束培养前16 h加入3H-TdR(1 μCi/孔)，常规收集细胞，置WALLAC1409液闪仪上检测，计算cpm值。 6 DC免疫的小鼠引流区淋巴结细胞数量的变化及组分的FACS分析 DC免疫1 w后，取小鼠右后腹股沟浅淋巴结，制备成单细胞悬液，细胞总计数，并用大鼠抗小鼠CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1-PE、33D1单抗于4℃标记30 min后洗2次，对于需间接标记的33D1样本管，加入FITC-羊抗大鼠单抗，4℃标记30 min后洗2次，流式细胞仪(FACS Calibur，BD)检测细胞表型，分析淋巴细胞组分。 7 CTL的体外诱导及杀伤活性的检测 DC免疫7 d后取脾脏T细胞(5×106 ml-1)与灭活的E22细胞按20∶1的比例，在含IL-2 100 U/ml的RPMI 1640完全培养基中培养，第5天收集活细胞作为效应细胞，Na251CrO4标记1 h的E22或EL-4或B16细胞作为靶细胞，以100∶1、50∶1、25∶1不同的效靶比，用51Cr 4 h释放法检测CTL的活性，同时设最大释放组和自然释放组。以下式计算杀伤率： 8 DC免疫后的保护作用 于DC免疫1 w后，皮下接种E22细胞(2×107/只)或B16(1×105/只)，每组10只，观察小鼠的存活期。 2 结果 1 腺病毒介导的LacZ基因修饰DC的效率 X-gal染色表明，腺病毒介导的LacZ基因修饰后24、48、72 h，80%以上DC细胞蓝染；而对照组即没有用LacZ转染的DC，不见细胞着色，表明腺病毒能有效介导模拟抗原β-gal基因转染至DC。 2 LacZ基因修饰DC的抗原提呈能力 如图1所示，LacZ基因修饰DC刺激同基因型鼠脾脏T细胞的增殖水平明显高于未用LacZ基因修饰的DC和对照腺病毒Ad5感染的DC(P＜05)。 人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现与确认，对肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段，如抗原基因免疫等对机体就具有一定的免疫保护作用；进一步研究表明，抗原基因免疫尽管能诱导机体产生一定程度的抗肿瘤免疫反应，但其效果仍不能令人满意［9］。将肿瘤抗原与抗原提呈细胞(主要是DC)相结合，通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应是肿瘤免疫治疗研究方面的热门课题。目前多用体外抗原致敏的DC免疫机体以诱导产生抗原特异性的抗肿瘤免疫反应，致敏DC的方法多用外源性肿瘤抗原，如肿瘤抗原多肽、肿瘤冻融抗原、肿瘤抗原蛋白等。本研究以β-gal作为模拟抗原，探讨抗原基因修饰的DC对机体特异性免疫反应的诱导作用，可为肿瘤的免疫治疗提供新的途径。 实验结果显示，AdLacZ可以高效转染DC，并可持续表达β-gal。用AdLacZ转染的DC免疫的小鼠，其引流区淋巴结细胞数显著高于非转染组，提示DC已迁移至淋巴结并激活了免疫细胞，使其发生了增殖。体外的混合淋巴细胞反应的结果显示，LacZ基因修饰的DC可以刺激E22细胞(表达β-gal)免疫小鼠的脾脏T细胞明显增殖，其刺激活性显著高于未用LacZ基因修饰的DC，提示LacZ基因修饰的DC有效地提高了模拟抗原β-gal。同时用LacZ基因修饰的DC免疫小鼠后，可以诱导产生较高水平的E22特异性CTL杀伤活性，而对EL-4细胞和B16细胞无杀伤活性，证实了LacZ基因修饰DC后，DC提呈了模拟抗原(β-gal)，诱导产生了针对模拟抗原——β-gal的特异性免疫反应。用LacZ基因修饰的DC免疫的小鼠，可抵抗野生型E22细胞的再攻击，而不能使接种B16的小鼠的存活期延长，说明LacZ基因修饰DC的免疫使小鼠获得了特异的抵抗E22肿瘤细胞的免疫保护力。上述结果提示，用携带编码肿瘤抗原基因的腺病毒作为载体转染DC，不但可以使DC得到高效转染，而且可持续表达该抗原，使抗原在DC内得到有效加工处理，以多个抗原表位提呈给T细胞，用其免疫后可以使机体产生显著的特异性抗肿瘤免疫反应。 研究结果也表明，将APC与肿瘤抗原及其基因结合起来用于肿瘤的主动特异性免疫治疗，具有一定的临床应用前景，而加强对DC等APC生物学特性和功能的研究以及发现更多的肿瘤抗原及其基因将为此奠定理论基础，具有重要的应用价值。此外，由于人们也发现一些肿瘤具有共享抗原(Shared antigen)的现象，因此构建一种表达肿瘤抗原或其多肽的腺病毒载体有可能会适用于多种肿瘤的治疗，该方面值得深入研究。 
免疫学是研究生物体对抗原物质免疫应答性及其方法的生物-医学科学。免疫应答是机体对抗原刺激的反应，也是对抗原物质进行识别和排除的一种生物学过程。 早在1000多年前，人们就发现了免疫现象，并由此发展起来对传染病的免疫预防。中国人首先发明了用人痘痂皮接种以预防天花，并且在十五世纪中后期的明朝隆庆年间有较大改进，并得到广泛的应用。后来，这一伟大发明传播到日本朝鲜、俄国、土耳其和英国等许多国家。后英国医生琴纳据此研究出用牛痘菌预防天花的方法，为免疫学对传染病的预防开辟了广阔的前景。全世界能在20世纪70年代末消灭天花，接种牛痘菌发挥了巨大作用。 19世纪末，法国化学家、微生物学家巴斯德于研究人和动物的传染病时，分析了免疫现象。并在琴纳的启发下，他发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗，预防动物的炭疽病；用减毒狂犬病毒株制成疫苗，预防人类的狂犬病。 著名动物学家梅契尼科夫在长期研究昆虫和动物细胞吞噬异物的现象后，于1883年指出体内的白细胞和肝、脾组织中的吞噬细胞具有吞噬和消化细菌的能力。德国细菌学家、免疫学家贝林于1890年发现免疫血清中有抗白喉毒素的抗毒素存在，日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素的抗毒素，两人共同研究血清疗法成功，对治疗白喉和破伤风患者取得良好效果。 从此，人们开始探讨免疫机制，把细胞的吞噬作用和抗毒素的中和作用看成是特异性免疫的根据，并逐步开展细胞免疫和体液免疫两大学派的争鸣。 细胞免疫学派的首领是梅契尼科夫，体液免疫学派的首领是德国细菌学家埃尔利希。埃尔利希用生物化学方法研究免疫现象，特别是以蛋白质化学和糖化学作为基础，探讨抗原和抗体的本质及其相互作用，于1896年提出抗体形成的侧链学说，这一学说直到今天还具有实际意义。两大学派的争鸣促进了免疫学的发展。 到20世纪60年代，对体液免疫的研究已经达到分子生物学的水平，已经弄清抗体的分子结构和功能。同时，对细胞免疫的研究也取得了明显的进展，过去认为小淋巴细胞是处于衰老终末期，而现在已肯定它是免疫系统的一大类具有免疫活性的淋巴细胞，在发挥免疫功能中起着重要作用。 此后人们进一步阐明了小淋巴细胞的结构，以及个体的发生和分化过程，特别是在杂交瘤技术方面取得了突破性的成就，这不仅丰富了一般细胞学的知识，而且为获得单克隆抗体或介质物质开辟了一条新的道路。 许多学者还注意到：当病原微生物入侵的时候，机体一方面能够获得特异性免疫，另一方面也会出现机体免疫损害。自从德国细菌学家科赫研究结核杆菌所引起的迟发型变态反应以来，人们逐步发现不仅细菌及其产物可以引起机体免疫损害，就连异种血清蛋白甚至许多很简单的化学物质再次进入机体，也会使机体组织遭到破坏。 20世纪中期，随着组织器官移植的开展，对移植物排斥、免疫耐受性、免疫抑制、免疫缺陷、自身免疫、肿瘤免疫等进行了深入的研究，认识到胸腺、法氏囊和脾脏在机体免疫功能中的重要意义，认识到过去把免疫过程局限于抗传染免疫的片面性，也认识到免疫应答是既可防御传染和保护机体、又可造成免疫损害和引起疾病的一个生物学过程。也就是说，免疫是生物体对一切非己分子进行识别与排除的过程，是维持机体相对稳定的一种生理反应，是机体自我识别的一种普遍生物学现象。 现代免疫学认为，机体的免疫功能是对抗原刺激的应答，而免疫应答又表现为免疫系统识别自己和排除非己的能力。免疫功能根据免疫识别发挥作用。这种功能大致有：对外源性异物(主要是传染性因子)的免疫防御；去除衰退或损伤细胞的免疫，以保持自身稳定；消除突变细胞的免疫监视。 只有免疫系统在正常条件下发挥相应的作用和保持相对的平衡，机体才能维持生存。如果免疫功能发生异常，必然导致机体平衡失调，出现免疫病理变化。 免疫系统在发挥免疫功能的过程中，识别是个重要的前提。一切生物都具有这种能力。单细胞生物只具有分辨食物、入侵微生物和本身细胞成分等低级的识别功能。脊椎动物的机体免疫系统逐渐完善，不仅具有完整的免疫器官和免疫细胞，而且免疫活性细胞还能产生特异性抗体和琳巴因子，从而准确地识别自己，排除异物以达到机体内环境的相对稳定，这对保护自己、延续种族和生物进化都有重大意义。高等生物的免疫系统充分发展，它对内外环境的各种抗原异物刺激既表现出多样性和适应性，又表现出特异性和回忆性，这对生物的进化过程、生物种系的生存和适应具有重大影响。 新中国成立以来，免疫学在医学上的应用已经有了很大进展。防治传染病的生物制品不仅满足国内的需要，而且支援其他一些国家。近年研制的新疫苗如化学疫苗、乙型肝炎疫苗等，已经接近世界先进水平。中国已经消灭天花，并且基本上消灭和控制了人间鼠疫和真性霍乱，等烈性传染病。脊髓灰质炎、麻疹、白喉、百日咳、破伤风等常见传染病的发病率已经大大降低。 现代免疫学逐步发展成为既有自身的理论体系、又有特殊研究方法的独立学科。它为生物学的研究提供了一些新的手段。 早在20世纪初，人们已经利用免疫学来区分人类的血型。植物分类学很早就应用免疫学的方法。在研究植物和动物的毒素时也采用了免疫学技术。例如，1889～1890年，人们用免疫学技术研究白喉毒素和破伤风毒素，随后又用它来研究植物毒素，如蓖麻毒素、巴豆毒素和动物毒素中的蛇毒、蜘蛛毒。另外，人们很早就利用沉淀反应鉴别动物的血迹。近年发展起来的一些新技术，如放射免疫、免疫荧光和酶免疫等，都为生物学提供了实用的研究手段。 从实质上说，现代免疫学不过是生物-医学的一个分支。但是，随着科学技术的发展，它本身又派生出许多独立的分支学科，例如，与现代生物学有密切关系的分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，与医学有密切关系的免疫血液学、免疫药理学、免疫病理学、生殖免疫学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等。 现在，对免疫学的研究已经达到细胞水平和分子水平，人们正在努力探讨生物的基本生理规律——免疫的自身稳定机制。医学中的许多重要问题，如自身免疫、超敏反应、肿瘤免疫、移植免疫、免疫遗传等，必将得到更好的解决。
