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（岳德超）药用真菌，是指能作为药物治疗疾病以及具有滋补作用的一类真菌。我国利用真菌作为药物有着悠久的历史，早在2550年前，就有用“神曲”治疗饮食停滞、胸膈满闷、消化不良，用豆腐上生长的霉治疗疮痈等记载。我国最早的药物书《神农本草经》（公元100—200年）及历代其它本草书中就记载有茯苓、猪苓、雷丸、马勃、灵芝、香菇、蝉花、冬虫夏草、木耳等真菌药物。这些药用真菌经历了上千年的医疗临床实践的考验，至今仍在广泛应用。据初步统计，全世界约有真菌25万种左右，已知有药效的约300余种。而人工培育作为药物使用的，只有其中很少部分。近30年来，我国药用真菌事业在不断发展，尤其是1980年首届全国药用真菌学术会议以来，药用真菌事业的发展更为迅速。应用现代科学技术研究真菌类中草药，已从真菌中发掘和开发出约30余种真菌药物制剂应用于临床。真菌类药物安全有效。受到广大患者的欢迎。一、药用真菌培育的概况我国是世界上培育药用真菌最早的国家。如早在800多年前，王祯（元）《农书》中就记载有香菇（蕈）的简易栽培方法。主要是人工在树杆上砍出花口，随野生香菇孢子自然飘落接种感染长出香菇。这种方法曾传至日本，约在300多年前，日本又进一步发展了。这一方法一直沿用到大约60多年前，被改用孢子水接种方法所代替。现今已发展到采用纯菌种全人工栽培方法。浙江省的龙泉、景宁、庆元是我国香菇栽培技术的发源地。1957年陈梅朋等，为了节约木材和克服产区的局限性，满足国内外市场的需要，开始采用木屑栽培香菇的研究，并于1960年初步获得成功。近年来，全国各地区因地制宜，利用各种农副产品作为栽培香菇及其它多种药用真菌的原料，其栽培方法也多种多样，如野（室）外有坑道、荫棚、溪沟等段木栽培，室内有瓶栽、袋栽、菌砖栽、盆栽等栽培方法，不仅大大提高了产量，质量也远比老法栽培的要好。目前，江苏已建成我国最大的香菇栽培基地，福建古田已建成香菇生产半自动化车间。栽培生产量较大，我国香菇产量达世界产量的40%，已跨入世界香菇生产大国的行列。茯苓在我国也已有数百年的栽培历史。如在《癸辛杂志》内就记载有“茯苓生于大松之根上矣。近世村民乃择其小者，以大松根破而系于其中，而紧束之，使脂液渗入于内。然后择地之沃者，坎而瘗之，三年乃取，则成大苓矣”。这种掘根后用原苓引种方法，现今在某些山区还常采用。在苏颂（宋）《图经本草》（公元1062年）上就记载有茯苓的采收方法：“以铁头锥刺地，如有茯苓，则锥固不拔，于是掘土取之”。这与现今采挖茯苓的“钻场法”是一致的。1970年以来，湖北、福建等地改革了用茯苓作种（肉引）培育的老方法，而采用纯菌种菌丝（菌引）接种的新方法，获得了较好的效果。现在正大力推广人工接种（菌引）栽培法。现今，全国已有许多省区进行茯苓的人工栽培，其中以安徽、河南、湖北、云南、四川、福建等省产量较大。我国栽培银耳也是世界最早的国家。据记载，银耳的栽培于1894年始于四川省通江县，其后传至贵州、湖北、陕西、福建等省。后来日本也仿效栽培。过去也是采用自然接种的老法栽培，产量低。现今不仅分离出优良的银耳纯菌种，而且还掌握了栽培银耳的新技术。如在接种银耳纯菌种以后，还需接种适当比例的银耳伴生菌——香灰菌丝，一般比例为1000∶1较好。其栽培方法除段木栽培外，还研究成功并大量推广瓶栽、菌床栽、塑料袋栽等方法，产量得到很大的提高。现在全国各地都有银耳栽培。不仅满足了临床的需要，亦为药理、化学等研究创造了条件。灵芝的栽培，首载于清《花镜》（公元1688年）一书内。目前，国内不少地区从事灵芝的瓶栽和段木栽培，并已发展至固体和液体发酵培养。猪苓过去全靠野生资源提供药用，山西古县、陕西秦岭有关单位，经过几年努力取得了野生变家栽的初步经验，云南省近几年在开展室内人工分离培养菌核方面进行了探讨研究，并研制出猪苓的水培法，1980年初步获得成功。1956—1959年间，中国医学科学院药物研究所，在麦角菌的人工接种栽培方面开展了研究工作并获得成功。在此基础上，又曾先后研究成功固体及液体培养麦角菌的方法，同时也曾对茯苓菌进行发酵培养的探索性研究，在瓶内培养形成菌核。到目前为止，国内外对虫草的人工培养技术、工艺等进行了大量的研究，1980年日本矢秋信夫报道了虫草属中80个种的人工培养，对含虫草菌素成分的蛹虫草的人工培养已获成功。但对我国的虫草（含虫草酸），日本研究很少。近年来我国对虫草蝙蝠蛾幼虫的饲养与虫草菌的分离培养研究取得了一定进展。1983年沈南英曾报道，于1981年曾在固体培养基上培养出1根冬虫夏草的子座，随后青海畜牧兽医研究所利用野生的子囊孢子，培育出菌株已在试管中长出了不成熟的子座。中国医学科学院药物研究所、中国科学院微生物研究所与福建清流县医院、海军医学研究所等单位，都相继从野生虫草菌上分离出不同菌株，并进行了发酵药理化学及临床疗效等的研究已通过成果鉴定，投入生产。而中国医学科学院药物研究所和江西国药厂于1987年第一个获得卫生部新药评审委员会的准产证书。但目前尚不能在人工培养条件下完成其全部生活史。除培养上述几种药用真菌外，近30年来，还成功地培养出紫芝、薄盖灵芝、雷丸、猴头、构菌、云芝、树舌、蜜环菌等多种药用真菌的子实体或菌核，并应用发酵工程技术大量培养出上述各种真菌以及亮菌、安络小皮伞、木耳、层卧孔菌、竹黄菌、白僵菌（或僵蚕蛹）等多种真菌的菌丝体供医药用。二、药用真菌培育的意义自古以来，我国就将多种真菌作为药物，并载入历代医药书籍中，它们是中药的一个重要组成部分。经历了千年以上的医疗实践的考验。同时我国也是世界上培育药用真菌最早和生产真菌类药物制剂较多的国家。尤其是近30年来，应用现代科学技术研究药用真菌，使药用真菌事业发展迅速。一些药用真菌经现代医药学研究证明，其功能是多方面的，且疗效安全可靠。我国真菌资源极为丰富，而被发掘作为药用真菌开发利用的仅是其中极少部分。由于野生资源远远满足不了临床用药的需要，因此，进行药用真菌培育的意义，不仅在于解决药源，亦可发掘和开发利用祖国医药学宝库，寻找新药以获得更大的社会和经济效益。三、药用真菌培育的研究现状我国近30年来，药用真菌培育研究取得了很大成绩，对一些传统培育的真菌如麦角、香菇、银耳、茯苓等进行了方法改革，采用纯菌种全人工接种培育的新方法，代替了过去自然接种的半人工培育的老方法，获得很大成功。现在所有药用真菌的培育，都采用纯菌种人工培育的新方法，并已普及推广，发展迅速。在江苏江阴县夏港乡，于1985年已建成我国最大的香菇栽培基地——长江香菇场投入生产。1986年在福建古田县已建成香菇生产半自动化车间。目前，药用真菌培育的研究，正为实现工厂化、自动化而努力。而更多的药用真菌培育的研究，则是应用现代生物技术深层发酵方法进行培育。此种方法不仅可大大缩短生产周期（4—15天），并可在工厂内有计划地、大规模培育生产，或应用此方法生物合成具有医疗价值的药物，如麦角新碱、银耳孢糖、香菇多糖、云芝多糖等等，其质量易于控制，成本低，可获得更大的社会和经济效益。据不完全统计，目前已建成发酵生产真菌类药物的工厂或车间，全国约有30多个，而从事药用真菌研究的单位则更多，生产出的真菌类药物制剂约有30余种。四、药用真菌的培育方法利用发酵法培育药用真菌，可以大大缩短生长周期，适合工厂化生产，培养条件容易控制，生产潜力大，为广泛地研究、开发和利用药用真菌开辟了新途径。人工栽培，是一种传统的生产方法，我国自古有宝贵的经验，尽管它有一定的缺点和局限性，但对一些野生药用真菌，还应试行人工栽培。（一）人工栽培段木栽培是模仿野生药用真菌生长的一种方法。即利用人工栽培，在段木上生长出子实体或菌核。此法适合于山林栽培。山林栽培要根据药用真菌的生长特性因地制宜选择场地和树种，采用适当的栽培工序，其过程为：准备段木，选择栽培场所，接种，管理，采收与加工。如在选地方面，木耳要选高山的半山腰，有适当的树木遮荫，背风而湿度大的地方。茯苓喜温暖，故选通风干燥的地方。对树种的要求，木耳以阔叶树为主，茯苓则选针叶树松木。木耳和银耳虽然生长环境及栽培工序相近，但也各有其特性。银耳生产要求砍“发浆树”，也就是抽出新树枝，树液流动时砍，而木耳却要求砍“收浆树”，即树叶枯黄，树干养料积累时砍。段木栽培，除木耳、银耳和茯苓广泛应用外，在香菇、灵芝上也在大力推广。木屑瓶栽主要原料为锯木屑，麦麸或糠皮。因为锯木屑是木材加工厂的副产品，所以发展药用真菌的瓶栽生产，是木材副产品综合利用的一个途径。木材种类繁多，质地不同，成分不同，如果不了解树种，盲目使用，会直接影响药用真菌的培养效果。一般阔叶树的木屑，特别是壳斗科的树种，最适于药用真菌的生长，它不仅质地较硬耐腐，而且配制的培养基营养充足，在接种后菌丝生长过程中营养消耗慢。含有杀菌物质的樟木和含油脂的松柏树种不适作瓶栽的原料（茯苓的培养除外）。一般木屑瓶栽，多应用于平原地区的室内，而壳斗科树材在平原地区来源困难，故也应因地制宜就地取材。要通过试验，选择来源方便的其它阔叶树锯木屑进行栽培。如果不知锯木的种类，应先晾晒，待油脂类物质及挥发性物质分解散失后再用。在培养料中掺入一些麦麸或糠皮增加氮源成分更利于菌丝生长。目前河南南阳应用棉籽壳代木屑作培养基，经过试验效果也较好。（二）发酵培养经化学分析及临床实践证明，以子实体入药的真菌，在它们的菌丝体中也含有与子实体相同的有效成分，同样具有疗效。凡属这类的药用真菌，均可采用发酵的培养方法。发酵培养可分固体发酵培养及液体深层发酵培养。固体发酵培养是以固体物质做培养料来培养菌丝体，再经提取加工进行制药的一种方法。不需要复杂的设备及高超的操作技术，投资也较少，更适合基层单位使用。凡适合栽培用的培养料皆可用于固体发酵，固体发酵生产是把长满菌丝体的培养料与菌丝体一并入药，因此要求培养料绝不能含有对人有毒及有害的成分。适合作固体发酵的材料有玉米粉、米糠、黄豆粉、麦麸等。用于生产的容器有浅盘（曲盘）扁瓶（柯氏瓶或茄瓶）、蘑菇瓶等。目前用此法生产的有猴头菌、蜜环菌、云芝、麦角菌及白僵菌等。液体深层培养其特点是将菌丝体接种于培养基中，给以适当的通气搅拌，使菌体大量繁殖的同时，产生和积累有效物质。培养过程一般在发酵罐中进行。因此需要发酵罐和压缩空气的设备以及过滤、浓缩、提取等设备。先在摇瓶中培养种子，再扩大到罐中培养。具体生产工艺为：斜面菌种→小摇瓶种子（一级）培养→大摇瓶种子（二级）培养→繁殖罐（种子罐）（三级）培养→发酵罐培养。培养基成分一般比较简单，可用豆饼粉，芝麻饼粉、蚕蛹粉、鱼粉等动植物性原料作有机氮源，适当加些糖类补充碳源再给少量无机盐类即可。深层培养的优点是培养量大，易于人工控制，培养周期短，不受气候、季节限制，常年可以生产。如培养灵芝子实体在栽培条件下需一个半月时间，而菌丝体深层培养下5—7天即可完成发酵生产周期。适于工业化生产，前途广阔。 
（冉砚珠）药用真菌培育的基本设备及操作技术和一般微生物培养相同。一、一般设备（一）无菌室（接种室）这是进行无菌操作的场所，无菌室要求严密，一般以4—5m2大小为宜，四壁最好涂以白漆，室内要整齐、干净，不要有对流空气，室内要安装灭菌用的紫外光灯和照明用的日光灯，并设有操作台和凳子，在无菌室门外最好再有小一倍的缓冲间，以防外面的空气袭入无菌室，二者的门不要对开，以左右的推拉门为好，这种无菌室一般设立在距菌室很近的菌种培养室的旁边。（二）无菌箱无菌箱也称接种箱（柜），是一木制架玻璃柜，是代替无菌室的。在箱内的两侧设有能滑动启闭的活门，在箱的前侧底上部有两个圆形手孔，以便接种时把手伸入进行操作。在箱内上壁最好按一支紫外光灯和日光灯管。无菌箱的边角应严密，不得有缝隙，以免杂菌侵入。无菌室和无菌箱在使用前必须经过杀菌。（三）超净工作台这也是进行无菌操作的装置，有各种型号和规格，有的适合单人操作，有的适合双人操作。它可以设置在无菌室或一般的房间中，但要求所处的环境空气流动较小、干燥、尘埃稀少，最好不要有人来回走动。这种装置在目前微生物和组织培养研究工作中普遍应用。（四）杀菌设备须有高压蒸汽灭菌锅，条件不足，亦可用蒸锅代替。主要用于培养基及玻璃器皿灭菌时使用。（五）温箱和培养室用于保温培养。根据不同目的选用不同设备。一般药用真菌母种的培养在温箱内进行，而子实体的培养就需要利用培养室。长子实体阶段，空气湿度要高，故培养室最好是水泥池，有水源并有下水道和通风换气的条件。此外设瓶架，备照明灯以及温、湿度计等。（六）干燥设备烤箱、烤房等。（七）常用的玻璃器皿试管用于培养斜面菌种。常用为180×20mm及150×15mm两种。三角瓶有100ml、500ml、1000ml及5000ml等规格。用于装无菌水和培养基。培养皿供平面培养用。常用的为直径9cm培养皿。吸管用于稀释分离菌种。有1ml和10ml。玻璃漏斗用于过滤和分装培养基用。酒精灯用于接种工具的火焰灭菌。其它用品尚需纱布、棉花、镊子、剪刀、线绳、试管架、天平、载玻片、盖玻片、显微镜等。如开展深层发酵，除上述设备外，尚需有摇瓶机、种子罐、发酵罐、过滤用的板框或离心机以及其它有关设备。二、基本操作技术（一）玻璃器皿的准备和清洁玻璃器皿的清洁与否直接影响实验结果，在使用前均需洗刷干净或再经灭菌、晾干或烘干后备用。新购买的玻璃器皿都有游离的碱性物质，最好的洗涤办法是用1%的HC1溶液处理一次，再用清水洗净。重铬酸钾洗涤液的配制浓配法：重铬酸钾（工业用） 40g浓硫酸（工业用） 800ml自来水 160ml稀配法：重铬酸钾（工业用） 50g浓硫酸（工业用） 100ml自来水 250ml将重铬酸钾溶解在水中，慢慢加入浓硫酸，边加边搅动（注意不可将重铬酸钾溶液往浓硫酸里倾倒，以免烧伤）。配好后贮存于广口瓶内，盖紧塞子备用。应用此液时，器皿必须干燥，同时应注意不要把大量还原物质带入。配好的溶液呈红色，浓厚并有红色小结晶。各种玻璃器皿的洗涤染菌或盛有药用真菌的器皿，先放入高压锅内灭菌20—30分钟，趁热倒出培养物再用热肥皂水洗刷并冲洗干净。以瓶壁不挂水珠为准。含有凡士林和蜡的器皿，需要预先除去油腻，必要时在5%苏打液内煮后再用热肥皂水洗刷。若作精密的试验或装化学药品时，则先用洗涤液浸泡，自来水、蒸馏水冲洗后烘干备用。带菌的移液管，应立即投入5%石炭酸溶液灭菌一天，再用自来水冲洗。新的载玻片和盖玻片，先浸于肥皂水（或盐酸酒精）内1小时，用水冲洗后软布擦干保存于95%酒精中。（二）培养基的配制培养基是根据药用真菌生长繁殖所需要的各种营养物质用人工配制的机质。其中除含有水分、碳水化合物，含氮化合物和少量无机盐类外，有时还需要各种必要的维生素。碳源是药用真菌的重要营养来源，它不但是合成碳水化合物及氨基酸的重要成分，而且也是生命活动的能量来源。氮素是合成蛋白质及核酸的重要原料，药用真菌生长发育的不同阶段，对碳氮比例的要求是不同的。在营养生长阶段，要求碳氮比为20∶1左右；在生殖生长阶段，则要求碳氮比为30∶1—40∶1。不同的药用真菌，对碳氮比的要求也各有不同。决定碳氮比因素有两个：一是细胞内成分的碳氮比，二是决定于真菌的不同种类对碳氮元素的同化能力。某些无机盐如钾、钠、钙、镁等磷酸盐和硫酸盐，虽然需要量很少，但也有助于药用真菌的生长发育。硫胺素（维生素B1）是碳代谢中转羧酶的重要成分，因此在配制培养基时，必须考虑到药用真菌的营养要求。培养基的种类很多，凡利用含有丰富营养的天然有机物质制成的培养基称为天然培养基，如马铃薯、麸皮、豆饼粉等。利用已知成分和数量的化学药品配制的培养基为合成培养基，如察氏培养基。但一般是采用一部分天然物质作为碳源、氮源及生长因素的来源，再适当添加一些无机盐类，称为半合成培养基，例如去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁75g；维生素B110mg，琼脂18g，水1000ml。培养基除了满足药用真菌的营养条件外，还要注意调节适宜的酸碱度。一般常用的培养基有固体及液体两种。（三）消毒灭菌为了分离得到所需要的药用真菌，并进行纯培养，所用的器皿及培养基都必须严格的消毒灭菌，杀死其中的微生物。干热灭菌主要在烤箱中进行。适合于玻璃器皿如吸管、培养皿、试管、三角瓶等，灭菌前器皿必须用纸包装好，温度慢慢上升，要求控制在160℃，保持1小时即可。灭菌后待温度下降至60℃以下方可取出物品，以免温度突然下降造成器皿的炸裂。湿热灭菌由于湿热的穿透力比干热的穿透力强，所以含有水分的培养基就采用这种方法。一般液体及琼脂培养基只要15磅压力半个小时，而锯木屑培养基则消毒时间延长1倍。土法灭菌是用蒸汽锅（或普通锅）蒸。这一般在没有高压灭菌条件或在高压灭菌破坏培养基的情况下采用。温度只能达100℃左右，为了达到彻底灭菌的目的，一般要进行三次间歇灭菌，每次圆气后保持1小时，然后室温下放置一天，第二天及第三天再各蒸一次。药物灭菌常用的有70%酒精，1%升汞水，10%漂白粉，40%甲醛溶液以及新洁尔灭等。此外还有火焰灭菌及紫外线灭菌。（四）接种与培养空气中杂菌微生物较多，这对药用真菌的纯培养是有害的，接种工作必须在无菌条件下进行。斜面接种接种时，把待接种用的试管斜面培养基和原菌种并列放在左手中，使中指夹于两试管之间，斜面朝上便于观看，右手拿接种针，蘸酒精在火焰上灼烧片刻（接种针进入试管的部分均要烧到），用右手小指、无名指和手掌拔掉试管棉塞，以火焰微微烤管口一周，使管口可能沾污的杂菌被烧死，这时接种针通过火焰伸入菌种管内稍冷却挑取少许菌丝连同培养基一起，迅速转入待接种的试管内，放在斜面的中央处，以利菌丝向四周生长延伸，注意不要使菌种沾靠管壁，然后将棉塞塞好，这就完成了第一管的接种程序。每管接种均如上述。一般每支原菌种管可扩接20支新管，放在恒温箱或恒温室培养。液体接种就是把菌种从斜面培养基上转接到液体培养基中，再放到适宜条件下振荡培养。接种方法基本同前，伹菌种管可以安置在菌种架上，按一定角度旋紧螺旋，三角瓶略向上斜以免基液流出，将取有菌种的接种小铲送入液体培养基时，用铲的背面在瓶壁靠近培养液处压碎菌块并投入液体中，同样塞上棉塞及灼烧接种工具。每管菌种可接2—3瓶培养液。如菌种为液体时，常用无菌移液管接种，接种量为10%，接种后放于恒温培养室的摇床上振荡培养。三、室外作业的一般工具及操作室外栽培多指段木栽培，一般利用的工具有斧、锯、钻、刮刀及塑料薄膜等。段木栽培要掌握好砍口深浅，稍达木质部为宜，有利菌的生长，砍口或打孔后需立即接种，以保接种质量。
