嗜血之翼
0引言 脆性X综合征（fragile X syndrome， FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation， FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致 FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］ 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究 1材料和方法 1材料 大肠杆菌DH5α， BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司 2方法 1表达载体的构建 根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分) PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCl2 0 μL，DMSO 5 μL，4× dNTP混合物（每种5 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板5 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶5 μL 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落 2融合蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3） 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达 3蛋白表达形式的分析 取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析 4融合蛋白的纯化 将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白 经过2次漂洗后再用5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集 取收集液，进行SDSPAGE分析 5CGGBP1与（CGG）29重复序列双链DNA结合 实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 经磁力吸附后，弃上清 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析 2结果 1原核表达载体的构建及鉴定 扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同 2CGGBP1的表达 用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的Eli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3） 3CGGBP1蛋白纯化 在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法 SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4） 4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列 双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5） 3讨论 关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］ 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础 
模式生物——大肠杆菌；摘要：模式生物是生命科学研究的重要材料，目前公认；的常见模式生物有大肠杆菌、噬菌体、酵母、线虫、果；关键词：大肠杆菌模式生物生命科学一、大肠杆菌简介；大肠杆菌(Escherichiacoli)是Es；二、大肠杆菌在生命科学研究的各领域所做的贡献；1大肠杆菌用于基因突变研究；突变型生物体在研究基因及蛋白质的性质的过程中扮演；定的诱变剂模式生物——大肠杆菌摘要： 模式生物是生命科学研究的重要材料， 目前公认的用于生命科学研究的常见模式生物有大肠杆菌、噬菌体、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等其中大肠杆菌对生命现象的揭密和探索等都所做出了重大贡献， 对其在生命科学研究中的历史轨迹、各自优势、技术手段、热点研究、发展前景等系统而又简要的了解， 有助于具体而又生动地体察到大肠杆菌在今天生命科学发展中的重要地位和推动生命科学不可替代的巨大潜力。关键词： 大肠杆菌 模式生物 生命科学 一、大肠杆菌简介大肠杆菌(Escher i chia col i ) 是Escherich 在1885 年发现的， 在很长的时间里， 一直被认为是正常肠道菌落的组成部分， 认为是非致病菌。直到20世纪中期，一些科学家才认识到一些含有血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。大肠杆菌作为研究生命科学中外源基因表达的宿主， 遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，所以大肠杆菌的大规模发酵经济， 倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系， 常作为高效表达的首选体系。20 世纪70 年代， 通过对大肠埃希菌的研究发现了操纵子学说并且绘制成了完整基因图谱， 基因组全序列完成， 全长为5 Mb， 共有4 288 个基因， 同时也搞清了所有基因的氨基酸序列。62% 的基因功能已经阐明， 仍有38% 基因功能尚未完全搞清。二、大肠杆菌在生命科学研究的各领域所做的贡献1 大肠杆菌用于基因突变研究突变型生物体在研究基因及蛋白质的性质的过程中扮演着重要角色。通过一定的诱变剂如: HNO2、烷化剂等， 可使野生型大肠杆菌诱发突变， 从而产生突变型。常见的大肠杆菌突变型大体有两种类型: ①合成代谢功能的突变型( anabolic functionalmutants)它是指在某些外界作用条件下， 基因组中部分基因发生突变时， 有些生化反应就不会正常进行， 因而使某些代谢失衡， 菌体也不会在基本培养基上存活， 这种突变多为条件致死突变。这种突变型的产生， 主要用于研究该突变基因的具体功能，对其进行准确定位。②分解代谢功能的突变型( catabolic funct iona lmutant)野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源， 因为它能把复杂的糖类转化为简单糖类， 这些降解功能是细菌体一系列酶的产生所致。而当决定该酶合成的基因发生突变后， 就产生了相应的突变型。运用这种方法， 人们可用一定的选择培养基对突变型进行筛选， 然后与野生型大肠杆菌基因组相对照， 可得该突变基因的相应碱基顺序， 从而为人们更好地了解某些基因的位置及功能奠定了基础。2 大肠杆菌“性别”的研究长期以来， 在遗传学研究中发现， 大肠杆菌主要通过无性方式繁殖。1946年，Lederberg和Tatum在研究大肠杆菌间遗传物质交换的过程中首次发现了大肠杆菌也有性别， 后来进一步研究表明， 决定大肠杆菌“性别”的主要因素是一重要质粒F因子。通过F因子进行遗传物质的传递大大提高了遗传物质重组的概率， 这就是现代基因工程研究中把质粒作为目的基因载体的一个非常有力的理论根据。另外，科学家通过F因子与大肠杆菌染色体某些基因进行重组， 形成了转移频率很高的Hfr菌株，通过Hfr菌株的不同非选择标记与F细菌染色体在不同时间形成重组子的频率， 创造性地提出了中断杂交作图法，从而对大肠杆菌菌株的部分基因进行了准确定位，为以后进行细菌染色体测序工作做出了一定的贡献。3 大肠杆菌与原核生物基因表达调控的研究在物体长期进化过程中， 经历了从原核到真核的进化过程。最简单的原核生物在不同的细胞周期需要不同的基因产物， 同时也需要不断地调控各种基因的表达活性， 以适应千变万化的环境条件。大肠杆菌作为一种结构简单、取材广泛以及培养较方便的原核微生物，早在40多年前， 法国科学家Jacob和Monod通过对不同大肠杆菌乳糖代谢突变型的调控基因作用的研究，他们发现在大肠杆菌中有3种酶基因一起被表达， 分别为-半乳糖苷酶、透性酶和酰基转移酶基因， 在此之前有一段DNA序列为基因表达的调控序列， 它包括阻遏物基因、启动基因和操纵基因。阻遏物与操纵基因结合而阻止结构基因表达; 当诱导物与阻遏物结合后， 就启动结构基因表达。这几个基因和一套表达的调控序列称为操纵子。这可以说是最早研究蛋白质表达的最简单的调控系统。4 基因工程中的质粒载体的重要来源质粒是把外源基因导入受体细胞使之得以复制和表达的载体。从20世纪70年代基因工程诞生以来， 科学家已通过实践从大肠杆菌中筛选出了多种性质优良的载体。如美国的Botivar等构建的PBR系列， 如PBR322、PBR325等， 其中PBR322就是目前运用较为广泛的一种。另外科学家们还根据具体需要改建了多种类型的优良载体， 并已应用于科研实践中， 收效明显。如: 中科院遗传所把带有固氮基因的质粒PRD1 从大肠杆菌（K12jc5564)转移到无固氮能力水稻根系菌4502Y中，表现出了很强的固氮能力。5 分子克隆中的受体基因工程也称为DNA重组技术， 它是将外源目的基因转入某种质粒载体， 然后，通过载体转入受体细胞， 然后受体细胞大量增殖形成无数克隆。大肠杆菌以其特殊的生物学特性而被选作为目的基因的受体， 应用十分广泛。在我国利用大肠杆菌作为受体细胞克隆目的基因生产基因药物，取得了良好的经济效益。例如: 中国科学院上海生化细胞所和复旦大学、第二军医大学合作， 将化学合成干扰素基因插入大肠杆菌， 该工程菌表达的干扰素，每升发酵液可达2×10^9单位， 生产前景看好。北京大学蛋白质及植物基因工程国家重点实验室以大肠杆菌为表达系统， 生产出了基因工程人胰岛素等。参考资料：《生命科学研究》 生命科学研究中常用模式生物 王凯《动物医学进展》 模式生物及其在分子生物学研究中的意义 罗盘棋， 王新华， 薄新文《生命的化学》 2000 年20卷2 期 酵母: 一种模式生物 刘 擎， 余龙 《生物学教学》 2005年(第30卷)第11期 模式生物 席兴字《生物学教学》2008年(第33卷)第2期 重要的模式生物- 大肠杆菌 王瀚
