Qi.L
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一， 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒， 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现，鉴别未知的或新出现的病毒， 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此， 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来， 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径， 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法， 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列， 查询基因数据库， 检出并确定未知病毒基因组序列， 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒， 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合， 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆， 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术， 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列，进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离， 最终对其基因组序列的测定分析， 是鉴别和判断的决定性依据之一， 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中， 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中， 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段， 供进一步克隆、测序、生物信息学分析， 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕， 也是最终测定分析， 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分， 可采用的技术方法也有所不同， 现将有关技术与其应用作一简介， 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法， 并不断得到演化， 发展和应用。病毒感染宿主细胞后， 与未感染的同类细胞相比， 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分， 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分， 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同， 可选用相应的代表性差异分析法， 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis ， DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ，T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ，D - DNA) 设为二组，分别用同一种限制性内切酶酶切处理，并接上5′端去磷酸化的人工接头，补齐接头后，加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后，切出的T - DNA 连上第二种人工接头，变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交，消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列，而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性，其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ，只有靶序列DNA呈指数扩增，因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后，以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ，将T- DNA 中呈现的差异部分作分离，克隆，序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ，在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型，用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术，Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因， 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis ， cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点，提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同，主要不同在于，采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶，它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高，平均酶切片段长度约256 bp ，保证了cDNA 序列群中绝大多数序列，至少被切出一个片段可扩增，供差异分析，分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济，可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒，其核酸可类似于mRNA 分离纯化，因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术，发现鉴定了TiV、MenV ，等〔16 ，17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med ， June 2007 ， Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights ( - ) - RNA 病毒，其核酸物质不似于mRNA ，需和宿主细胞总RNA 同时分离，并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ，由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因，从这样的总RNA 抽提物中，用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术，发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合，共计4 096 个序列模式，以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型，筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后，称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率，数据表明，非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验，结果表明，二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等，而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ，检测人工合成的RNA ，前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录，串联cDNARDA 技术，检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ，其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法，但对于检测鉴别在宿主细胞中复制，但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言，也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理，Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ，SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于，SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份，分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ，分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同，T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减， T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物，加入过量变性D - cDNA ，作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交， 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端，用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物，作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物，因两端分别具有接头1 和2 ，可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ，因一端具接头序列，被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列，因抑制性PCR 效应，在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此，SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增，使假阳性大大降低，提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术，结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能， 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型，通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选，在被筛的96 个克隆里，T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中，序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等，其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下，发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ，RCA) ，扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下，环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物，加入φ29 DNA 聚合酶，以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型，建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板，进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下，以随机引物引导，合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时，在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下，下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时，被从单链环状模板上“甩”出的互补链，又成为新的模板，随机引物与之结合，在φ29 DNA 聚合酶作用下，继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换，最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法，并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中，由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因，将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内，病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于，依据病毒颗粒小、具一定密度，用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心，从样品中分离出病毒颗粒，DNA 酶酶解游离的DNA ，裂解病毒颗粒，抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理，对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后，作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ，SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐，合成第二链DNA ，或反转录，合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后，酶切片段两端连接一种接头，并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物，作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品，结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中，可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物，此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸，3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med ， June 2007 ， Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时，6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火，在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物，进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量，包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中，9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内，5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增，获取、鉴定未知病毒的基因片段，尽管灵敏度不够高，但其实验时间较短，步骤相对简单，对于病毒拷贝数高，时间紧急的样品鉴别，是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样，感染病毒后需要检验的样品又各不相同，因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术，也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断，这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈，必然还会有新的改进、创新技术出现，将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C ， Gunther S ， Preiser W， et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ，2003 ， 348 : 1967 - 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背景分为你所研究的课题的大背景，比如某种疾病，其发生率，致死率，在各国的情况。小背景，如果你要研究治疗方法，那么现在的治疗的现状是怎样的，有哪些方法，这些方法存在什么问题。研究意义就是指，从上面的这些问题中，你要解决的特定问题。希望对你会有些帮助。
病毒感染占传染病的百分之七十五至百分之八十，而且大部分为急性感染；并且当前没有有效地治疗方法；病毒学是分子生物学和基因工程研究的有力工具；病毒的持续性发展造成免疫抑制。提到病毒，也许大家再熟悉不过了，熊猫烧香、灰鸽子哈哈，大家肯定注意到了，我说的是计算机病毒，他们当然不会感染到人体，我今天要说的是生物学上的病毒比如流感病毒，HIV、乙肝病毒。不管是计算机病毒还是生物病毒 他们都有一个共同特点那就是他们喜欢搞破坏，计算机病毒会弄得你的电脑信息泄露、死机甚至崩溃。而生物病毒他们会威胁到人类的生存，比如历史上赫赫有名的天花病毒，这种病毒繁殖快，能在空气中以惊人的速度传播，每4名病人当中便有一人死亡，而剩余的3人却要留下丑陋的痘痕天花，18世纪，欧洲蔓延天花，死亡人数曾高达1亿5千万人以上。甚至更多。病毒的厉害可见一斑。 由于病毒是目前已知结构最为简单的生命单位，基于它在细胞外的相对简单性和细胞内的病毒与宿主细胞之间相互作用的复杂性的突出特点，由此成为分子生物学研究复制、信息传递、突变以及其它分子生物学问题的理想对象。自从1953年DNA的双螺旋结构理论建立以来，新技术和新方法的广泛应用，使得病毒学的研究步入分子病毒学的发展时期利用分子生物学方法进行研究，其结果不仅促进了病毒学的研究，反过来对分子生物学的发展也起到巨大的推动作用，我们从几个方面来说明病毒学对现代分子生物学的重要性。 一、腺病毒载体 腺病毒载体是全世界从事分子生物学研究实验室广泛使用的一种病毒载体，腺病毒具有易感性、致病力低、宿主范围广、稳定性好、易进行重组DNA操作、病毒滴度高、易于浓缩和贮存以及介导基因转移效率高、能容纳较大基因片段等优点。因而腺病毒载体在疫苗制备，外源基因表达，传染病和遗传病的基因治疗等方面被广泛研究和应用，被认为是基因治疗最有前途的病毒载体之一。 腺病毒在人和动物中广泛存在，是迄今在形态结构、基因组成和复制机理等生物学特性方面研究得最为详尽的病毒之一。腺病毒无囊膜，直径80～110 nm，呈二十面体对称，线状的双股DNA与核心蛋白形成直径60～65 nm的髓芯，被包裹于衣壳内。 二、逆转录酶 又称 RNA 指导的 DNA 聚合酶，是以 RNA 为模板合成DNA的酶。这种酶是 1970 年美国科学家特明 (H M Temin) 和巴尔的摩 (D Baltimore) 分别于动物致癌 RNA 病毒中发现，他们并因此获得 1975 年度诺贝尔生理学或医学奖。 病毒逆转录酶含 Zn2+，以脱氧核苷三磷酸为底物，从 5’- 到 3’- 合成 DNA，反应需要引物。这个酶在许多方面与 DNA 聚合酶相似。艾滋病毒也是一种反转录病毒。有的逆转录酶已提纯，可作为合成某些特定 RNA 的互补 DNA 的工具酶，也可用于 DNA 的序列分析和克隆重组 DNA。 三、M13噬菌体与DNA测序 M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。 M13改造的载体可以作为质粒载体使用，如 M13mp18/19，M13含有单链环状DNA。M13mp是野生型经修饰而成的，复制型（RF）为双链环状DNA，可作为克隆载体，常用于双脱氧测序，含有部分LacZ基因，在LacZ基因上含有多隆位点。M13mp18与M13mp19的多克隆位点含有相同的限制性内切酶位点，但方向相反。 M13mp18/19也可以包装成噬菌体制作单链DNA模板用于DNA测序，是PCR技术建立之前的主要测序手段，Sanger用此材料建立的测序方法获诺贝尔奖。 四、昆虫杆状病毒表达载体 昆虫杆状病毒表达载体是全世界范围内各实验室广泛使用另一种真核表达载体。昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA 病毒，其基因组在90～230 kb 之间，具有编码上百种蛋白质的能力。该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。由于昆虫杆状病毒DNA 具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，能容纳大片段外源DNA 的插入和表达，且表达的蛋白具有翻译后修饰。 五、病毒疫苗 分子病毒学在理论上的迅速发展，给病毒性疾病的防治实践带来了新的突破。如果说，由受染动物组织制备的病毒疫苗为第一代产品；由受染组织培养细胞制备的为第二代；那么，采用DNA重组技术生产的病毒疫苗则为第三代。采用病毒基因重组技术生产的病毒疫苗，对预防病毒性疾病将做出重大的贡献。如每个人小时候都注射接种的乙肝病毒疫苗。 病毒学对分子生物学的贡献远不只此，从历届诺贝尔生理学和医学奖就可以看出来，比如：1966年FP 劳斯（美国人）发现肿瘤诱导病毒（VIT）;CB哈金斯（美国人）发现内分泌对于癌的干扰作用 1969年德尔布吕克（德国细菌遗传学家）、赫尔希(美国遗传学家）、卢里亚(S美国微生物学家）发现了病毒的复制和遗传结构复制机制和遗传结构； 1975年关于肿瘤病毒（TV）和细胞遗传之间的相互作用 1989年JM毕晓普、HE瓦慕斯（美国人）发现了动物肿瘤病毒（ATV）的致癌基因源出于细胞基因，即所谓原癌基因 2008 年德国科学家哈拉尔德·楚尔·豪森因发现人乳突淋瘤病毒（HPV）引发子宫颈癌、两名法国科学家弗朗索瓦丝·巴尔－西诺西和吕克·蒙塔尼发现人类免疫缺陷病毒（HIV）。 总之，病毒学对现代分子生物的研究有着重要作用，两者相辅相成，互相促进。尤其是在这个时代，病毒说来就来，非典、禽流感、甲流这些闹的人心惶惶的恐怖名字面前，分子病毒学的研究能让我们更好地了解病毒、防御和抵抗病毒的侵袭、拿病毒为我们所用。（二）病毒的危害与防治摘要：病毒感染占传染病的百分之七十五至百分之八十，而且大部分为急性感染；并且当前没有有效地治疗方法；病毒学是分子生物学和基因工程研究的有力工具；病毒的持续性发展造成免疫抑制。谈到历史上或现在一直使人感到恐慌的天花、鼠疫、艾滋病、禽流感等等骇人听闻的疾病，我们都会想到---病毒---一个让人不寒而粟的名字，总是与疾病和死亡紧密联系在一起。病毒能侵入人体，在寄主细胞内快速繁殖，使寄主细胞破裂死亡，再继续感染其他细胞体，其感染速度快，流行范围广，有些很难在机体内彻底被消灭，这也是某些病毒性疾病的可怕之处。
写意义的时候根据你的选题来决定形式可以分现实意义和理论意义也可以不细分，把目的和意义和在一起写，总之突出你观点的新颖和重要性即可；建议可以从这两点来叙述，不过要根据自己的选题，不要生搬硬套: (你的选题)是前人没有研究过的，也就是说研究领域中一个新颖有意义的课题，被前人所忽略的 前人有研究过，或者说阐述过但是没有阐述论证的足够全面，你加以丰满，或者驳斥前人的观点，总之，意义和目的一定要叙述的清晰并且是有一定新意的；其次注意自己所使用的理论，你是用什么理论证明你的观点；也要叙述清楚，否则难以有说服力；在做文献综述和国内外研究水平的评价等等也要有翔实的根据；这样才能衬托出你的选题的意义所在。研究的目的、意义也就是为什么要研究、研究它有什么价值。这一般可以先从现实需要方面去论述，指出现实当中存在这个问题，需要去研究，去解决，本论文的研究有什么实际作用，然后，再写论文的理论和学术价值。这些都要写得具体一点，有针对性一点，不能漫无边际地空喊口号。主要内容包括：(1) 研究的有关背景(课题的提出)： 即根据什么、受什么启发而搞这项研究。(2)通过分析本地(校) 的教育教学实际，指出为什么要研究该课题，研究的价值，要解决的问题。
