yll1995
GC-O法在食品风味分析中的应用摘要：气相色谱-嗅觉测量法(gas chromatography-olfactometry，GC-O)是一种从复杂的混合物中选择和评价气味活性物质的有效方法。本文简单介绍了它的发展、原理、四类强度分析方法及其在食品风味分析中的应用。关键词：气相色谱-嗅觉测量；气味活性物质；风味；应用对于很多食品，风味物质的组成和含量决定着这种其质量，即风味是食品质量的重要指标之一。在过去的几十年间，很多风味方面的检测技术得到了发展，包括仪器检测(如GC-MS)和感官检测(如GC-O)[1]。它们被用来分析食品中的挥发性风味化合物的含量和强度大小。在国内，对于挥发性化合物的分析运用得最多的还是GC-MS。但是，食品中产生的大量挥发性化合物中，只有小部分对风味有贡献，且它们的含量和阈值都很低。对于静态顶空分析而言，其顶空的挥发物浓度一般在10-11至10-4g/L，但只有当挥发物浓度≥10-5g/L时才能被MS检测到，也就是说MS只能检测出含量丰富的挥发性物质。而且，GC-MS是一种间接的测量方法它无法确定单个的风味活性物质对整体风味贡献的大小。而气相色谱-嗅觉测量法(GC-O)却能解决上述问题。因为人的鼻子通常比任何物理检测器更敏感。人类鼻子所能感知到的食品基质中挥发物的强弱与挥发性化合物释放的程度及其本身的性质有关。因此，从某一食品基质的所有挥发性化合物中区分出风味活性物质(或关键风味物质)成为风味分析的一项重要任务[2-4]。1 GC-O简介GC-O法是将气相色谱的分离能力与人类鼻子敏感的嗅觉相联系，从复杂的混合物中选择和评价气味活性物质的一种有效方法，其中人的鼻子起到了检测器的强大作用。GC-O最早是在1964年由Fuller等提出的，当时是以直接吸闻气相色谱毛细管柱的流出物这种最简单的形式进行的。到了1971年有人将GC流出组分与湿气相结合，通过薄层层析后再进行吸闻。在20世纪80年代中期，美国Acree和德国Ullrich的研究人员几乎同时使用定量稀释分析法来进行风味强度的评价[5-8]。而如今，GC-O已发展了许多更为先进的检测方法，如时间-强度法(time-intensity methods)等。GC-O的原理非常简单，即在气相色谱柱末端安装分流口，将经GC毛细管柱分离后得到的流出组分分流到检测器[如氢火焰离子检测器(FID)或质谱(MS)]和鼻子。当样品进入GC，经由毛细管柱分离后，流出组分被分流阀分成两路，一路进入化学检测器(FID或MS)，另一路通过专用的传输线进入嗅探口。嗅探口通常是圆锥形的，由玻璃或者聚四氟乙烯制成。加热传输线是为了防止被分析物在毛细管壁上凝结。将湿润的空气加入到流出组分中，可防止评估人员的鼻黏膜脱水。2 GC-O的分析方法为了更好地收集和处理GC-O数据，评价单个风味活性物质对样品整体风味的贡献大小，使结果更具重复性和可靠性，研究人员在过去的几十年间，开发了很多先进的检测技术对香味进行强度分析。GC-O的这些强度分析方法又被称为嗅探技术(sniffing)，通常有四类[9]，包括稀释法(dilution analysis methods)、频率检测法(detection frequency methods)、峰后强度法(posterior inten-sity methods)以及时间强度法(time-intensity methods)[3，10]。也有文献将嗅探技术分成三类，即频率检测法、阈值稀释法以及直接强度法[4]。1稀释分析法稀释法是基于连续稀释一种气味直到在嗅探口感觉不到它的存在，即逐步稀释到嗅觉阈值的方法。例如：Charm分析(combined hedonic aroma response measurement)[7]和芳香萃取物稀释分析(aroma extraction dilution analysis，AEDA)[11]。AEDA法在GC-O的检测分析中是比较常用的。萃取物通常按照1:2、1:3、1:5或1:10的稀释度进行稀释(R)，然后再用气味测量法对每个稀释度的样品进行评价。评价员只需说明在哪个稀释度下仍然能闻到被分析物，并描述该气味。稀释因子(FD因子)就是一种风味化合物所能感知到的最后的一个稀释度。当萃取物按照一定的稀释度稀释P(P=0，1，2，3，……)倍之后，所得到的FD因子就是RP[4]。AEDA的分析结果可以用图来表示，它的横坐标是保留时间(RT)或保留指数(RI)，纵坐标是稀释因子(FD Factor)，常用对数(lgR FD)表示。这种方法已用于许多不同食品中风味活性物质的强度测定，包括烤牛肉、小麦面包、鸡汤、大豆油等食品中[3]。AEDA法除了将萃取物(液体)梯度稀释后进行分析外，也有使用静态顶空进行分析的。稀释步骤可以改为不断降低顶空体积[12]或者改变分流比[13]。2频率检测法频率检测法最早是由Linssen等提出的，采用一组评价员(通常需要6至12个评价员组成一个评价小组)同时记录一种气味化合物，并用能够感知这种气味的所有评价员数目(检测频率)来表示此种气味的强度[14]。在由频率检测法得到的谱图中，保留时间(RT)或保留指数(RI)为横坐标，能感知到一种气味化合物的所有评价员的数目为纵坐标。频率检测法最大的优点就是简便、耗时少，对评价员的要求不高。这种方法的重复性比较好，结果能够反映各评价员的敏感性差异。但此方法得到的结果只与给定浓度的被分析物中的风味物强度有关。如果被分析物的浓度总是高于检测阈值以至于所有评价员都能感觉到，那么某一给定的样品在不考虑其浓度的情况下，可能也会得到相同的结果[4]。3峰后强度法峰后强度法就是出峰后一定时间内记录气味强度变化的方法[15]。它将感觉到的气味强度在标度上进行评估，常见的有5~9点标度法。以5点标度法为例：1-极弱；2-弱；3-中等；4-强；5-极强[16]。此方法对于感官评价员来说属于中等难度，在使用标度时会有很大的差异。4时间强度法时间强度法是基于气味强度的数量估测，评估人员记录气味强度和持续时间并描述该气味[15]，例如：OSME和指距法(Finger Span)。OSME最早是由McDaniel等提出的[17]。评价员使用可变电阻，通过上面指针的移动来确定强度。同时，指针所在位置的电脑图解反馈将帮助评价员调整到感知的强度位置。由此方法得到的风味谱图与传统检测器得到的谱图相似。它的横坐标是保留时间，纵坐标是风味强度，峰的高度对应于最大的气味强度，而峰宽则对应于气味的持续时间[4]。指距法是在1967年由Ekman等提出的。Etie vant[18]等还利用指距与跨通道匹配相结合(cross-modality match-ing with the finger span，GC-O-FSCM)的方法对气味强度进行了评价。它使得拇指和其他手指之间的距离能够得到精确地测量和采集。两手指间的距离正比于气味的强度，而滑动的时间对应于气味的持续时间。3 GC-O在食品风味分析中的应用GC-O具有很广泛的适用性，它在香精、香水的分析方面展示了强大的检测功能。由于GC-O拥有一些GC-MS所没有的优点，它受到了越来越多的重视，尤其是在食品风味分析方面。1 GC-O在肉品风味中的应用Machiels等[19]利用GC-O对两种商品爱尔兰牛肉(标签上分别为“传统”和“有机”)的挥发性风味化合物作了评价，并通过GC-MS鉴定了这些风味化合物。由八名感官评价员组成一个评价小组，使用GC-O中的频率检测法对风味物质进行了强度分析，同时描述了该气味。81种挥发性风味物质被鉴定出来，其中的11种具有气味活性(第二种样品中具有14种气味活性物质)。两种肉共有的风味物质为：甲硫醇、二甲基硫醚、2-丁酮、乙酸乙酯、2-甲基丁醇和3-甲基丁醇、一种未知化合物、2-辛酮、正癸醛以及苯并噻唑。根据频率检'测，气味特征以及挥发性风味物质本身这三方面综合考虑，两种肉品存在着很大的差异。但就频率检测法所得到的结果来看，风味活性物质除了二甲基硫醚外，其他的在统计学上没有显著性差异。田怀香等[20]采用自制简易的Sniffing装置，接GC-MS的毛细管柱出口，对顶空固相微萃取法提取的金华火腿的风味物质进行柱后感官嗅闻评价，有效地将原样品风味轮廓中的88种化合物精简到22种比较重要的化合物，其中包括9种醛类化合物(2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、己醛、庚醛，3-甲硫基丙醛、辛醛、苯乙醛、壬醛)、4种含硫化合物(甲硫醇、二甲基二硫化物、3-甲硫基丙醛、二甲基三硫化物)及3种杂环化合物(甲基-吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃)，它们是金华火腿的重要的风味化合物，对金华火腿的整体风味贡献很大。2 GC-O在乳品风味中的应用GC-O在乳制品方面的应用包括对新鲜牛奶和加热牛奶、奶酪、酸奶以及牛奶巧克力等的风味研究分析。Frank等[21]通过固相微萃取对乳酪的香味进行浓缩，并通过GC-MS和GC-O分析了Cheddar、Hard grating以及Mold-ripened blue三种乳酪的风味。他们将鉴定出的挥发性化合物与之前报道的进行比较发现：由嗅觉测量法鉴定出的组分中甲硫醇、蛋硫醛、二甲基三硫化物以及丁酸存在于所有的乳酪中。这说明它们是形成基本的乳酪风味物质。在某些乳酪中发现，大量的烷基-吡嗪酰胺传递烤坚果味、生马铃薯味以及类似肉汤的风味。总的来说，由嗅觉测量法鉴定的风味活性物质与文献报道的相一致。3 GC-O在酒类风味中的应用国外对于酒类风味的分析主要集中在葡萄酒。Gomez-Miguez等[22]利用GC-O法以及定量分析技术对产自西班牙南部的一种新鲜的白葡萄酒(Zalema wine)的挥发性组分进行了研究。这是利用嗅觉测量法对该葡萄酒品种风味的首次报道。经过定量化学分析得出的71种挥发物中，有23种化合物的浓度是高于嗅觉阈值的。依据气味活性值(OAVs)，大多数有效的气味化合物是发酵物质，主要是脂肪酸和它们的乙酯。其中的两种酮、两种醇、三种挥发性的硫醇以及两种羰基化合物的OAVs都大于1。GC-O的分析结果验证了上述结果，表明五种酯类(乙酸异戊酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯和辛酸乙酯)以及异戊醇和β-突厥烯酮是Zalema葡萄酒最有效的气味物质。Campo等[23]对Malvazia、Boal、Verdelho以及Sercial这四种标志性的葡萄品种所酿制的马德拉白葡萄酒的风味谱图进行了感官、GC-O以及GC-MS的分析研究。这些葡萄酒的风味特征有：糖果味、坚果味、焦香味以及干果味等。利用GC-O法分析了动态顶空技术得到的萃取物。他们将马德拉葡萄酒的GC-O谱图与三种新鲜的单一品种(Malvazia、Boal、Verdelho)酿制的白葡萄酒谱图进行比较，使得鉴定出与马德拉葡萄酒相关的气味物质成为可能。他们指出，GC-O是一种筛选存在于葡萄酒中的活性气味物质的有效工具。同样，Falcao等[24]也对产自巴西葡萄酒风味进行了研究，首次使用GC-O法对该品种的葡萄酒进行风味分析。通过频率检测法发现了14种重要的风味物质，其中的9种被GC-MS鉴定出来。4 GC-O在水果风味中的应用水果风味是一种由特征挥发性化合物组成的混合体，包括碳水化合物(糖：葡萄糖、果糖和蔗糖)、有机酸(柠檬酸和苹果酸)以及一些常见的无特征气味的挥发性酯类。单独的某种水果可能就有超过100种不同的挥发性物质，当然，这也会随着水果不同的成熟阶段而发生变化。是相对于其他食物，水果中的挥发物含量比较高，一般超过30×10-6g/g，这就能使分析研究得到一定的简化[25]。Guillot等[26]按照感官特性选择了六种杏品种进行实验，它们分别是Iranien、Orangered、Goldrich、Hargrand、Rouge du Roussillon以及A4025。它们的风味强度通过顶空固相微萃取-气味测量法(HS-SPME-Olfactometry)进行确定和分级。在这六个杏品种中，HS-SPME-GC-MS鉴定出了23种常规的挥发物。最终，通过HS-SPME-GC-O分析发现乙酸乙酯、柠檬烯、r-癸内酯等10种化合物是对杏风味有贡献的。5 GC-O在茶风味中的应用窦宏亮等[27]采用顶空固相微萃取(HS-SPME)提取绿茶和绿茶鲜汁饮料样品中的挥发性成分，用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)结合气相色谱-嗅觉测量法(GC-Olfactometry)，根据挥发性化合物的保留指数(RI)，鉴定了绿茶和饮料中的主要风味化合物，并对二者香气组成及相对含量差异进行了比较。结果表明，采用GC-MS/GC-Olfactometry/RI法能有效地鉴别和确认绿茶和绿茶鲜汁饮料中香味化合物的类别、香味强度及其对总体香气的贡献。Schieberlea等[28]采用芳香萃取物稀释分析法对红茶茶叶的挥发物进行分析。在25种气味活性化合物中(它们的FD值范围在16～256)，芳樟醇、β-紫罗兰酮、3-羟基-4，5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、苯乙酸等六种物质含有最高的风味稀释因子(FD)。定量分析结果表明，所浸提的红茶汁显示了相同的气味。但用热水浸提可以得到更多的风味物质，尤其是醇类。除了以上提到的五个方面外，也有人利用GC-O分析了咖啡[25]、豆类[29]、辣椒[30]等食品的风味。4总结和展望近年来，食品风味方面的研究越来越受到人们的重视，尤其是国外，他们通常都会将经过前处理(如同时蒸馏萃取、固相微萃取等)的样品进行GC-MS以及GC-O分析，得到其中的关键挥发性化合物。GC-O法是研究食品风味的一个有力工具，对鉴别特征香味化合物、香味活性化合物、具有有效香味的化合物及用来确定香味化合物的香味强度和作用大小都是非常有用的。但是它也有很多不足之处，例如：频率检测法耗时最少，最容易进行，但准确度不高；稀释法在评判化合物对样品整体风味贡献大小方面很具说服力，但是工作量很大、耗时，特别是对于一个比较大的评价小组来说；强度法是最难进行的，对评价员的要求很高。另外，每一个评价员的嗅闻灵敏度是有差异的，即使是同一天的不同时段也会有所不同，而且不同的评价员对同一种风味的感知也有差异。针对上述不足之处，可以结合几种分析方法同时对食品基质进行风味分析，使结果更可靠。至于评价员，可以经过专业的闻香培训，毕竟拥有一个好的评价小组是进行GC-O分析的前提。参考文献：[1]夏玲君，宋焕禄香味检测技术——GC/O的应用[J]食品与发酵工业，2006，32(1):83-[2]FRIEDRICH J E，ACREE T EGas chromatography olfactometry(GC/O)of dairy products[J]International Dairy Journal，1998，8(3):235- 
一、食品发酵与酿造的历史 发酵的英文“fermentation”是从拉丁语“ferver”即“发泡”、“翻涌”派生而来的，因为发酵发生时有鼓泡和类似沸腾翻涌的现象。如中国黄酒的酿造和欧洲啤酒的发酵就以起泡现象作为判断发酵进程的标志。可以说，人类利用微生物进行食品发酵与酿造已有数千年的历史，发酵现象是自古以来就已被人们发现并掌握的，但由于对发酵与酿造的主角——微生物缺乏认识，发酵与酿造的本质长时间没有被揭示，始终充满神秘色彩。因而在19世纪中叶以前，发酵与酿造业的发展极其缓慢。 在微生物的发现上做出重大贡献的是17世纪后叶的列文虎克(Leewenhoch)，他用自制的手磨透镜，成功地制成了世界上第一台显微镜，在人类历史上第一次通过显微镜用肉眼发现了单细胞生命体——微生物。由于当时“自然发生说”盛极一时，他的发现并没有受到应有的重视。在随后的100多年里，对各种各样微生物的观察一直没有间断，但仍然没有发现微生物和发酵的关系。直到19世纪中叶，巴斯德(Pasteur)经过长期而细致的研究之后，才有说服力地宣告发酵是微生物作用的结果。 巴斯德在巴斯德瓶中加入肉汁，发现在加热情况下不发酵，不加热则产生发酵现象，并详细观察了发酵液中许许多多微小生命的生长情况等，由此他得出结论：发酵是由微生物进行的一种化学变化。在连续对当时的乳酸发酵、转化糖酒精发酵、葡萄酒酿造、食醋制造等各种发酵进行研究之后，巴斯德认识到这些不同类型的发酵，是由形态上可以区别的各种特定的微生物所引起的。但在巴斯德的研究中，进行的都是自然发生的混合培养，对微生物的控制技术还没有很好掌握。 其后不久，科赫(Koch)建立了单种微生物的分离和纯培养技术，利用这种技术研究炭疽病时，发现动物的传染病是由特定的细菌引起的。从而得知，微生物也和高等植物一样，可以根据它们的种属关系明确地加以区分。从此以后，各种微生物的纯培养技术获得成功，人类靠智慧逐渐学会了微生物的控制，把单一微生物菌种应用于各种发酵产品中，在产品防腐、产量提高和质量稳定等方面起到了重要作用。因此，单种微生物分离和纯培养技术的建立，是食品发酵与酿造技术发展的第一个转折点。 这一时期，巴斯德、科赫等为现代发酵与酿造工业打下坚实基础的科学巨匠们，虽然揭示了发酵的本质，但还是没有认识发酵的化学本质。直到1897年，布赫纳(Buchner)才阐明了微生物的化学反应本质。为了把酵母提取液用于医学，他用石英砂磨碎酵母菌细胞制成酵母汁，并加人大量砂糖防腐，结果意外地发现酵母汁也有发酵现象，产生了二氧化碳和乙醇，这是用无细胞体系进行发酵的最初例子。这使人们认识到，任何生物都具有引起发酵的物质——酶。从此以后，人们用生物细胞的磨碎物研究了种种反应，从而促成了当代生物化学的诞生，也将生物化学和微生物学彼此沟通起来了，大大扩展了发酵与酿造的范围，丰富了发酵与酿造的产品。 但这一时期，发酵与酿造技术未见有特别的改进，直到20世纪40年代，借助于抗生素工业的兴起，建立了通风搅拌培养技术。因为当时正值第二次世界大战，由于战争需要，人们迫切需要大规模生产青霉素，于是借鉴丙酮丁醇的纯种厌氧发酵技术，成功建立起深层通气培养法和一整套培养工艺，包括向发酵罐中通人大量无菌空气、通过搅拌使空气均匀分布、培养基的灭菌和无菌接种等，使微生物在培养过程中的温度、pH、通气量、培养物的供给都受到严格的控制。这些技术极大地促进了食品发酵与酿造工业，各种有机酸、酶制剂、维生素、激素都可以借助于好气性发酵进行大规模生产，因而，好气性发酵工程技术成为发酵与酿造技术发展的第二个转折点。 但是，这一时期的发酵与酿造技术主要还是依赖对外界环境因素的控制来达到目的的，这已远远不能满足人们对发酵产品的需求，于是，一种新的技术——人工诱变育种和代谢控制发酵工程技术应运而生。人们以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制的条件下培养，有选择地大量生产人们所需要的物质。这一新技术首先在氨基酸生产上获得成功，而后在核苷酸、有机酸、抗生素等其他产品得到应用。可以说，人工诱变育种和代谢控制发酵工程技术是发酵与酿造技术发展的第三个转折点。随着矿产物的开发和石油化工的迅速发展，微生物发酵产品不可避免地与化学合成产品产生了竞争。矿产资源和石油为化学合成法提供了丰富而低廉的原料，这对利用这些原料生产一些低分子有机化合物非常有利。同时，世界粮食的生产又非常有限，价格昂贵。因此，有一阶段，发达国家有相当一部分发酵产品改用合成法生产。但是由于对化工产品的毒性有顾虑，化学合成食品类的产品，消费者是无法接受的，也是难以拥有广阔的市场的；另外，对一些复杂物质，化学合成法也是无能为力的。而生产的厂家既想利用化学合成法降低生产成本，又想使产品拥有较高的质量，于是就采用化学合成结合微生物发酵的方法。如生产某些有机酸，先采用化学合成法合成其前体物质，然后用微生物转化法得到最终产品。这样，将化学合成与微生物发酵有机地结合起来的工程技术就建立起来了，这形成了发酵与酿造技术发展的第四个转折点。 这一时期的微生物发酵除了采用常规的微生物菌体发酵，很多产品还采用一步酶法转化法，即仅仅利用微生物生产的酶进行单一的化学反应。例如，果葡糖浆的生产，就是利用葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖的。所以，准确地说，这一时期是微生物酶反应生物合成与化学合成相结合的应用时期。 随着现代工业的迅速发展，这一时期食品发酵与酿造工程技术也得到了迅猛的发展，主要在发酵罐的大型化、多样化、连续化和自动化方面有了极大的发展。发酵过程全部基本参数，包括温度、pH、罐压、溶解氧、氧化还原电位、空气流量、二氧化碳含量等均可自动记录并自动控制的大型全自动连续发酵罐已付诸应用。发酵过程的连续化、自动化也成为这一时期重点发展的内容。20世纪70年代发展起来的DNA重组技术，又大大推动了发酵与酿造技术的发展。先是细胞融合技术，得到了许多具有特殊功能和多功能的新菌株，再通过常规发酵得到了许多新的有用物质。如植物细胞的融合，可以得到多功能的植物细胞，通过植物细胞培养生产保健和药品。近年来得到迅猛发展的基因工程技术，可以在体外重组生物细胞的基因，并克隆到微生物细胞中去构成工程菌，利用工程菌生产原来微生物不能生产的产物，如胰岛素、干扰素等，使微生物的发酵产品大大增加。可以说，发酵和酿造技术已经不再是单纯的微生物的发酵，已扩展到植物和动物细胞领域，包括天然微生物、人工重组工程菌、动植物细胞等生物细胞的培养。随着转基因动植物的问世，发酵设备——生物反应器也不再是传统意义上的钢铁设备，昆虫的躯体、动物细胞的乳腺、植物细胞的根茎果实都可以看做是一种生物反应器。因此，随着基因工程、细胞工程、酶工程和生化工程的发展，传统的发酵与酿造工业已经被赋予崭新的内容，现代发酵与酿造已开辟了一片崭新的领域。发酵工业的发展史一、国外发酵工业的发展概况发酵工业的发展史，可以划分成五个阶段。在19世纪以前是第一个阶段。当时只限于含酒精饮料和醋的生产。虽然在古埃及已经能酿造啤酒，但一直到17世纪才能在容量为1500桶（一桶相当于110升）的木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造。即使在早期的酿造中，也尝试对过程的控制。历史记载，在1757年已应用温度计；在1801年就有了原始的热交换器。在18世纪中期，Cagniard-Latour， Schwann和Kutzing分别证实了酒精发酵中的酵母活动规律。Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律。在18世纪后期，Hansen在Calsberg酿造厂中开始其开拓工作。他建立了酵母单细胞分离和繁殖，提供纯种培养技术，并为生产的初始培养形成一套复杂的技术。在英国麦酒酿造中并未运用纯种培养。确切地说，许多小型的传统麦酒酿造过程，至尽仍在使用混合酵母。醋的生产，原先是在浅层容器中进行，或是在未充满啤酒的木桶中，将残留的酒经缓慢氧化而生产醋，并散发出一种天然香味。认识了空气在制醋过程中重要性后，终于发明了“发生器”。在发生器中，填充惰性物质（如焦碳、煤和各种木刨花），酒从上面缓慢滴下。可以将醋发生器视作第一个需氧发生器。在18世纪末到19世纪初，基础培养基是用巴氏灭菌法处理，然后接种10%优质醋使呈酸性，可防治染菌污染。这样就成为一个良好的接种材料。在20世纪初，在酿酒和制醋工业中已建立起过程控制的概念。在1900年到1940年间，主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮。其中面包酵母和有机熔剂的发酵有十分重大进展。面包酵母的生产是需氧过程。酵母在丰富养料中快速生长，使培养液中的氧耗尽。在减少菌体生长的同时形成乙醇。限制营养物的初始浓度，使细胞生长宁可受到碳源的限制，而不使受到缺氧的影响；然后在培养过程中加入少量养料。这个技术现在成为分批补料培养法，已广泛应用于发酵工业中，以防止出现缺氧现象；并且还将早期使用的向酵母培养液中通入空气的方法，改进为经由空气分布管进入培养液。空气分布管可以用蒸汽进行冲刷。在第一次世界大战时，Weizmann开拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵。所用的过程，至今还可以认为是一个在较少的染菌机会下提供良好接种材料和符合卫生标准的方法。虽然丁醇丙酮发酵是厌氧的，但在发酵早期还是容易受到需氧菌的污染；而在后期的厌氧条件下，也会受到产酸的厌氧菌的污染。发酵器是由低碳钢制成的具有半圆形的顶和底的圆桶。它可以在压力下进行蒸汽灭菌而使杂菌污染减少到最低限度。但是，使用200M3容积的发酵器，使得在接种物的扩大和保持无杂菌状态都带来困难。1940年代的有机溶剂发酵技术发展，是发酵技术的主要进展。同时，也为成功地进行无杂菌需氧过程铺平道路。第三期发酵工业的进展，是按战时的需要，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素。青霉素的生产是在需氧过程中进行，它极易受到杂菌的污染。虽然已从溶剂发酵中获得很有价值的知识，然而还要解决向培养基中通入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌问题。早期青霉素生产与溶剂发酵的不同点还在于青霉素生产能力极低，因而促进了菌株改良的进程，并对以后的工业起着重要的作用。由于实验工厂的崛起，使发酵工业得到进一步的发展，它可以在半生产规模中试验新技术。与此同时，大规模回收青霉素的萃取过程，也是另一大进展。在这一时期中，发酵技术有重大的变化，因而有可能建立许多新的过程，包括其他抗生素、赤霉素、氨基酸、酶和甾体的转化。在60年代初期，许多跨国公司决定研究生产微生物细胞作为饲料蛋白质的来源，推动了技术进展。这一时期，可视作发酵工业的第四阶段。最大的有机械搅拌发酵罐的容积，已经从第三阶段时的80M3扩大到150M3。由于微生物蛋白质的售价较低，所以必需比其他发酵产品的生产规模更大些。如以烃为碳源，则在发酵时对氧的需求量增加，因而不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐应运而生。这种过程如果进行连续操作，则更为经济。这个阶段中，工业上普遍采用分批培养和分批补料培养法。连续发酵是向发酵罐中连续注入新鲜培养基，以促使微生物连续生长，并不断从中取出部分培养液，它在大工业中的应用极为有限。与此同时，酿造业中也研究连续发酵的潜力，但在工业中应用的时间极短。如ICI公司还在使用3000M3规模连续强制循环发酵罐。超大型的连续发酵的操作周期已可超过100天，其问题是染菌。严重性已大大超过1940年代的抗生素生产。这类发酵罐的灭菌，是通过下列手段而达到的：即高度标准化的发酵罐结构、料液的连续灭菌和利用电脑控制灭菌和操作周期，以最大限度地减少人工操作的差错。发酵工业发展史中的第五阶段，是以在体外完成微生物基因操作，即通常称为基因工程而开始的。基因工程不仅能在不相关的生物间转移基因，而且还可以很精确地对一个生物的基因组进行交换。因而可以赋予微生物细胞具有生产较高等生物细胞所产生的化合物的能力。由此形成新型的发酵过程，如胰岛素和干扰素的生产，使工业微生物所产生的化合物超出了原有微生物的范围。为了进一步提高工业微生物常规产品的生产能力，也可采用基因操作技术。确信基因操作技术将引起发酵工业的革命，并出现大量新型过程。但是要开拓新的过程，还是要依靠大量细胞培养技术，它曾经从酵母和熔剂发酵开始，经由抗生素发酵，而到大规模连续菌体培养。
微生物的发酵作用对传统酿造食品安全性的影响摘要：对我国酿造食品的工艺特点和生物转化作用机制进行了阐述，分析了发酵过程中微生物的发酵作用对食品酿造过程中的生物性污染、化学性污染和物理性污染等食品安全性因素的影响，得出我国传统酿造食品由于微生物的发酵作用经过分解、消除和滤过等过程使其更具有安全性特征。关键词：传统酿造食品；发酵作用；食品安全食品为人类提供营养要素，同时也是微生物生长的天然培养基。我国传统酿造食品（酱油、酱类、食醋、腐乳、白酒、酸菜、泡菜等）多以谷类、豆类、蔬菜等为原料，将自然界的群体微生物引入发酵过程共同作用形成风味独特的食品。通过微生物发酵作用引起的生物转化食品具有良好的品质、感官特性、可消化性和营养价值。随着现代工业发展，工业“三废”中的有毒有害物质（如重金属毒物、N-亚硝基化合物、多环芳烃化合物等）在环境中污染逐渐增多，这些有毒有害物质通过土壤、水体、空气等环境污染酿造食品原料、食品容器和包装材料等。化学农药、化肥和仓储药剂（如杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、粮食熏蒸剂、防护剂等）通过各种渠道污染食品酿造原料，作为发酵原料的粮食在生产、加工、贮藏等环节受到霉菌、细菌、寄生虫等生物污染。本文从我国传统食品酿造的工艺特点、微生物的生物转化机制对食品污染的作用进行分析，探究传统酿造食品在发酵过程中的安全性问题。1传统酿造食品的工艺特点我国传统酿造食品历史悠久，经过千百年的实践形成独特的酿造工艺特点。1敞口固态发酵传统酿造一般采用固态发酵技术，在添加谷糠或稻壳等辅料之后进行边糖化边发酵的“双边发酵”工艺，具有发酵时间长、产品风味浓厚、管理粗放等特点。整个过程采用敞口式工艺，充分利用物产资源与自然资源，制曲时富集各种功能性微生物，驯化和培育了特定的微生物群落结构体系，将主体微生物与环境微生物融为一体。同时摸索出一套完整的温度、湿度、酸碱度、通气量、发酵时间等酿造工艺条件，创立了产品增香与各种加工技术，对创造我国独特的酿造食品风味和保证产品质量具有十分重要的作用。2多种微生物共同作用酿造过程是一个复杂的生物化学反应过程，产品品质主要取决于多种微生物的协同作用。微生物主要来自于曲种和环境，包括霉菌、酵母菌、细菌等，各种微生物共栖生长，赋予醅料复杂而完整的酶系，具有较强的糖化、液化和蛋白分解能力。各种微生物在发酵过程中盛衰交替，此消彼长，协同作用，产生单一菌种所不能比拟的作用。在发酵过程中水解与发酵交替进行，避免过高浓度底物对有益微生物和生化反应的负面影响。发酵时间长，酶促反应深入而完善，代谢产物丰富多彩，产品风味醇厚、浓郁[1-2]。3多样的产品防腐措施传统酿造食品采取灵活多样的产品安全措施，一是依靠代谢产物本身的防腐作用（如白酒是依赖酒精的杀菌作用，食醋是靠醋酸的抑菌作用）；二是利用高浓度的食盐抑制微生物的生长繁殖（如酱油、酱、腐乳等）。2传统酿造食品的生物转化机制传统酿造过程是多种微生物将原料中的淀粉、蛋白质和脂类等大分子物质转化为产品的各种小分子风味物质，构成产品的主要成分。酱油的风味物质按其化合物性质可分为醇类、酯类、酸类、醛类及缩醛类、酚类、呋喃酮类和含硫化合物等[3-4]；食醋中除含有主要成分醋酸外，还含有糖分、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮类等化学成分[5-6]。酱油和食醋等酿造食品的风味物质构成产品特有的色、香、味，其来源主要是2方面，一是植物原料的“主生物质”（如蛋白质、淀粉等“，次生物质”如丹宁、芳香族化合物、异黄酮）；二是微生物及其酶对植物原料作用后的代谢产物。此外，白酒、酱油、食醋等在贮藏过程中各种代谢产物相互作用形成各种风味物质，据分析酱油含有300多种风味物质[4]。1多糖的转化传统酿造食品原料的主要成分为淀粉，它在曲霉菌分泌淀粉酶的作用下分解为葡萄糖。这些单糖一部分作为霉菌、酵母菌和细菌生长繁殖的碳源和能源，一部分在微生物的作用下形成发酵产品的各种代谢产物。由淀粉转化来的代谢产物包括各种酸类、醇类、酚类以及低聚糖等[7]。酱油的糖分包括由大豆转化的低聚糖（如水苏糖、棉子糖等）和由小麦淀粉转化的蔗果三糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等，而酿造食品的酸类、醇类、酚类等小分子产物是构成产品风味的物质基础。2蛋白质的转化
