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收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1，2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA 0mg/L（单位下同）+ TDZ 03；MS + 6-BA 0 + TDZ 03 + NAA 1 培养基能较好地诱导分化出丛生芽， 继代增殖培养中与MS + 6-BA 0 + TDZ 03 + NAA 1 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达67；适宜的生根培养基为MS + 6-BA 0 + NAA 5，生根率达67%，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号：Q1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1，2， LEI Jiang-li2， WU Yan-min3， LÜ Hui2， YU Ji-hua1(College of Agronomy， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu China; Shenzhen Institute of LandscapeGardening， Shenzhen 518003， Guangdong China; Biotechnology Research Institute， Chinese Academy of AgriculturalSciences， Beijing 100081， China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA 0mg/L+ TDZ03mg/L; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA 0mg/L +TDZ 03mg/L + NAA 1mg/L; using MS + 6-BA 0mg/L + TDZ 03mg/L + NAA 1mg/L asproliferation medium， an optimal proliferation rate was When the two kinds of mediumused alternatively， the effect was The optimum rooting medium was MS + 6-BA 0mg/L +NAA 5mg/L， the rate of rooting could reach 67%， and cultured in this medium， the plant grewwell and easy to Key words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2，3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008，37(1):33-Subtropical Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法1 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。2 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（1%升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 1%升汞5min、2%次氯酸钠 + 1%升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。3 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 8。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析1 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。1%升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 1%升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 1%升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用1%升汞处理10min 进行外植体消毒。2 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2，4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，05～0μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为33%，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达33%，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/5 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况1%升汞10min 30 5 67 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 00 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 33 20%有轻微药害2%次氯酸钠+1%升汞5min 30 10 33 3%有轻微药害2%次氯酸钠+1%升汞10min 30 5 67 7%有药害第1 期 王丹，等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。3 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（03mg/L）的分化促进作用较高浓度（3mg/L）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当TDZ03mg/L 时， NAA 1mg/L 促分化作用显著优于NAA5mg/L。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。4 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA 0 + NAA 5培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2，4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 33 参考[2]3 5 0 0 0 0 33 参考[3]4 3 0 0 0 0 675 2 1 0 0 0 006 2 5 0 0 0 677 2 2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 2 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 2 012 0 1 0 0 2 33 参考[8]13 0 0 5 0 1 3314 0 0 1 0 1 6715 8 0 0 0 03 3316 5 0 5 0 03 00表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 0 5 03 30 00d 20d ++18 0 5 30 30 67cd 50bc ++19 0 1 03 30 67a 67a ++20 0 1 30 30 33cd 46bc ++21 0 5 03 30 33c 60ab ++22 0 5 30 30 67d 33c ++23 0 1 03 30 67a 60ab ++24 0 1 30 30 33ab 57b +25 0 5 03 30 00b 53b ++26 0 5 30 30 67d 37c +27 0 1 03 30 00a 73a ++28 0 1 30 30 67d 37c +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜05＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 5 30 19 33b +30 0 0 30 21 00a ++31 0 5 30 20 67ab +++32 0 0 30 16 33c ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，1%升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA 0 + ZDT 03 + NAA 1 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA 0 + TDZ 03+ NAA 1 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA 0 + NAA 5 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W， et The genus Canna in Northern South America[J] Acta Bot N， 1971，20(6): 663-[2] 刘文萍，等 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J] 北方园艺， 2001(6): [3] 丁爱萍，等 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J] 园林科技， 2006(1): 11-[4] Singh N D， et The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L Millsp)[J]Plant Science， 2003，164(3): 341-[5] 王关林，等 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J] 植物学通报， 1997，14(3): 47-[6] 宣朴，等 生姜茎尖组培快繁技术研究[J] 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新中国成立后，党和政府非常重视中医药的发展，各省、自治区、直辖市都有药材公司领导和组织各地药材生产和科研工作。吉林、北京、四川、浙江、广西、云南、海南等地先后成立了代表不同气候类型的中草药引种栽培研究机构及基地，许多研究所设有栽培研究室。吉林农业大学、中国药科大学（南京）、西北大学、四川省中药学校（峨嵋）开设药材专业，培养了大批专业科技人才。在调查总结和试验研究的基础上，各地先后出版了《中药材生产技术》、《药用植物栽培技术》、《中国药用植物栽培学》等书籍不下几十种，这些出版物对中药材的科研、生产均发挥了积极的指导作用。在改进栽培技术方面，如四川省中药研究所调查并总结出了提高石柱黄连产量的六条栽培技术。江苏省昆山县根据南京药学院研究结果，将薏苡由旱生改为湿生，使产量由每667米产40千克，增加到300千克。中国医学科学院药用植物研究所，由于掌握了天麻与蜜环菌及其他共生菌关系，天麻大面积人工种植成功，解决了天麻供不应求的问题。人参和西洋参最适宜用森林腐殖质土栽培，由于农田栽培人参和西洋参获得成功，解决了参业发展与林业发展的矛盾。对皮类、树脂类药材的研究近年来也有很大的进展，如杜仲的环状剥皮取代了砍树剥皮，广东进行了天竺黄形成原因及人工栽培天竺黄的研究，使产量提高4～5倍。在良种选育方面，江苏省海门县用薄荷的两个品系杂交育成了精油含量高达85%的高产品种海香1号。中国医学科学院药用植物研究所用新状元和武陟1号杂交、小黑英和大青英杂交分别育成了地黄高产新品种北京1号和北京2号。用野生药用齿瓣元胡与正品浙江元胡杂交，育成了综合齿瓣元胡块茎大、生长旺盛，家栽浙江元胡有效成分含量高、繁殖快的杂交元胡新品种杂交9号。该品种适宜北方栽种，比引种浙江元胡产量高50%，填补了北方无栽培元胡良种的空白，用系统育种法，经20年努力，与吉林省集安一参场协作，育成了高产优质的人参新品种边条1号。吉林左家特产研究所育成了有效成分含量较高的黄果人参新品种。浙江鄞县农业局、杭州药物所分别育成了能增产10%左右的浙贝新品种梅园1号、新岭1号。宁夏农业科学院育成了果大质优的枸杞新品种宁杞1号，四川省中药研究所育成了高产的附子、薏苡等新品种，全国各地育成的4倍体药材新品种有牛膝、党参，板蓝根、薄荷、大蒜、丹参等。野生药材先后引为家种的有天麻，黄芩、细辛、甘草、五味子、桔梗、半夏、百合、何首乌、山茱萸、栀子、绞股蓝、石斛、防风、龙胆、肉苁蓉、知母、冬虫夏草、猪苓、川贝母、紫草、柴胡、天门冬、薤白等。新中国成立50年来，对治疗严重疾病的一些新药材进行了野生变家栽的驯化工作，如抗癌药材喜树、美登木、长春花等；治疗心血管病药材月见草、黄草，毒毛旋花、小叶洋地黄等；抗衰老药材小蔓长春花、白首乌；对肺脓疡有特效的金荞麦；对疟疾的治疗有特效的青蒿等。从国外引种名贵药材方面也作了大量工作，已引种成功的有颠茄、洋地黄、蛔蒿、番红花、水飞蓟、西洋参等。特别是很多南药如金鸡纳、白豆蔻、丁香、马钱、安息香、古柯、儿茶、番泻叶、胖大海、澳洲茄、印度罗芙木等，这些药材过去依赖进口，不能满足需要，现在很多已引种成功，逐步做到自给。总之，我国药用植物栽培无论是品种数量，还是种植规模均处在世界领先地位。在引种驯化、种植技术、品种选育等方面都积累了丰富的经验，取得了许多新成果，为人民的医疗保健、国家的经济建设作出了贡献，既为实现我国中医药产业现代化打下了基础，也是对祖国和世界医药学的贡献。
